α－L－巖藻糖苷酶的研究進展

黃麗君 綜述，姚正國 審校（湖北省黃岡市黃州區人民醫院檢驗科 438000）

α－L－巖藻糖苷酶（a－L－Fucosidase，AFU）是一種溶酶體酸性水解酶，廣泛分布于人體內的各種組織、細胞及體液中。1977年研究者在動物實驗中觀察到Morris鼠肝癌組織中AFU活力較正常肝臟高7倍，且與腫瘤生長期有關。1980年法國學者首先在3例原發性肝癌血清中發現AFU活性升高，并提出把AFU作為診斷肝癌的一種新的標志酶，并被后來的眾多研究所證實。近年來，AFU檢測的方法學研究，及腫瘤或非腫瘤性疾病的血清AFU水平變化的研究也日益增多，并且有不同的評價。

1 AFU的生物學特性

AFU是一種溶酶體酸性水解酶，廣泛分布于人體各種組織及體液中，如胎盤、胎兒組織、腦、肺、肝、胰、腎，以及血清、尿液、唾液、淚液等均含有AFU。其中以肝、腎等組織活性較高，細胞內的AFU主要位于溶酶體內。健康人血清AFU的相對分子質量達（270～390）×103，亞單位的相對分子質量為（56.0±2.8）×103和（54.0±2.7）×103，大約有8%左右的健康人血清AFU呈低活力。白細胞AFU的相對分子質量為（30～130）×103，肝臟 AFU的相對分子質量為（220～240）×103，亞單位的相對分子質量為（53.00±2.65）×103和（49.00±2.45）×103［1］。用神經氨酸苷酶處理后，血清AFU相對分子質量顯著下降到（37±4）×103。而且他們在等電聚焦電泳中行為出現顯著改變，在pH 3.8～5.9范圍的酶活性基本消失，而在pH 6.0～7.2范圍的酶活性增高。分子三級結構的改變和（或）較多唾液酸的聚集可能是AFU相對分子質量較大的原因。經過1%十二烷基硫酸鈉（SDS）和5%巰基乙醇處理的血清、肝的AFU，用聚丙烯酰胺凝膠電泳可見2種相對分子質量十分接近的亞單位。

有資料顯示，用聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳分析純化的人血清AFU同工酶顯示出2條主帶及5條細帶；用蔗糖密度梯度層析法分析透析后的人血清AFU同工酶顯示出8條同工酶區帶，用Sephadex G200薄層等電聚焦及Aephadex G25柱等電聚焦分離AFU同工酶，可出現6條區帶；用瓊脂糖凝膠作為支持物做等電聚焦電泳，出現8條同工酶區帶［1］。說明人體AFU分子根據其糖鏈組成與結構不同，可出現不同的同工酶表現形式，其原因可能與下列因素有關：（1）與結構基因有關；（2）與酶蛋白四級結構的差異有關；（3）與AFU分子中唾液酸含量有關。

AFU的反應特性：腦與肝AFU具有抗原一致性，用肝AFU制備的抗體IgG可與純化的血清AFU發生免疫沉淀反應；血清AFU的反應最適在pH 4.8左右，在pH 6.1處可出現一個次要的“最適”pH峰，與腦、肝AFU的pH反應曲線類似，而且3者的Km值比較接近，提示血清和腦、肝AFU之間存在抗原特性和動力學特征的一致性。

2 AFU的測定方法

2.1 熒光法 研究者利用AFU水解4－甲基傘型酮－α－L－巖藻吡喃糖苷釋放4－甲基傘型酮，用堿性緩沖液終止反應，并使產物呈現熒光，用360nm或365nm激發波長和400nm或448 nm發射波長檢測熒光強度，對照不同濃度4－甲基傘型酮制備的標準曲線求酶的活性，此法敏感性高，適用范圍廣。但該法對儀器條件要求高，不適合用于自動化檢測。

2.2 終點比色法 以對硝基苯酚α－L－巖藻糖苷為底物，在AFU催化下生成α－L－巖藻糖苷和對硝基苯酚，對硝基苯酚在堿性溶液中呈黃色［2］，用分光光度計在405nm波長處檢測。本法反應時間長，且操作較繁瑣，干擾因素多，也不適用自動化檢測。于秀艷等［3］對其進行了改進，利用對硝基酚毫摩爾消光系數為18.5的特性，根據AFU在pH 5.0的條件下催化對硝基苯－巖藻糖吡喃糖苷，生成對硝基酚和巖藻糖，在405nm波長下，對硝基酚有一吸收高峰，測其吸光度變化，不必做標準曲線，便可準確測出AFU含量。因本法采用因數兩點法，可去除因溶血黃疸給試驗帶來的干擾。

2.3 速率法（連續監測法） 血清中AFU催化2－氯－對硝基酚α－L－巖藻吡喃糖苷（CNP－F）水解生成2－氯－對硝基酚（CNP），在405nm或410nm波長監測CNP的生成速率，計算出AFU活性。本法測定對膽紅素250mg／L、血紅蛋白230mg／L、抗壞血酸6g／L無明顯干擾［2］。該法操作簡便，測定時間短，靈敏度和抗干擾性都有提高，適用于各種半／全自動分析儀器。依據底物的不同，速率法又可分為PNP法、CPNP法、MGCNPF法3種。PNP法底物為對硝基苯α－L－巖藻吡喃糖苷，靈敏度一般，對溶血、黃疸仍表現出一定的基質效應，精密度也較差。CPNP法采用氯化對硝基苯α－L－巖藻吡哺糖苷作底物，靈敏度和精密度較PNP法都有了很大的改善，但仍未完全解決溶血、黃疸及脂血的基質效應。MGCNPF為新型底物，靈敏度、精密度、抗干擾性及試劑穩定性都很高，是當前最為先進的檢測方法。

3 AFU的臨床意義

AFU是在20世紀70年代用于診斷一種AFU缺乏的遺傳病，因先天缺乏AFU可以引起巖藻糖貯積病，對組織細胞、尿液和血清中AFU測定可協助該病的診斷，并借以與其他遺傳性粘多糖貯積病鑒別。自1980年有研究者發現原發性肝癌患者血清AFU升高，并被后來的研究證實之后，國內外許多學者對AFU在臨床應用方面進行了大量的探討。從此，對AFU的臨床意義有了全新認識。

3.1 原發性肝癌（primary hepatic cancer，PHC） 近20多年來，有關AFU于肝癌的相關性研究眾多。有資料表明，血清AFU對原發性肝癌診斷的陽性率在64%～84%之間，特異性在90%左右。血清AFU活性升高幅度和陽性率于AFP無相關性［4］。AFU血清水平和陽性率與腫瘤大小無關，病灶小于3cm的患者血清AFU升高的陽性率為70.8%～80.0%，明顯高于AFP的陽性率（37.5%～40.0%）。何謙等［5］通過誘發大鼠肝癌的動物實驗發現，AFP直到第18周肝癌演變期與健康對照組比較差異無統計學意義，而AFU從第14周早期肝癌形成期就與健康對照組比較差異有統計學意義，并且隨著肝癌的動態發展過程進一步升高，從而證實AFU對原發性肝癌具有較高的診斷學價值。

3.2 肝炎和肝硬化 大多數肝硬化和一部分乙肝患者的血清AFU活性均有不同程度的升高，可能與肝細胞損傷、酶逆流入血有關。乙肝患者血清AFU活性和血清ALT活性的升高程度具有高度的正相關。經抗肝炎治療后，血清ALT活性下降，AFU活性也迅速下降，ALT活性持續不變或上升者，AFU活性也不下降。肝硬化患者血清AFU活性長期升高提示易發展為肝癌，或表示病情危險，或已有小病灶肝癌存在。所以血清AFU活性測定有助于乙肝病情發展的預測及肝硬化患者預后的觀察［6］。

3.3 白血病 曾有報道B細胞性慢性淋巴細胞白血病患者白細胞AFU活性明顯低于其他類型白血病，并認為這與B細胞屬性無關，而是惡性細胞的增殖產物。趙平等［7］報道，急性白血病患者血清AFU活性高于健康對照組，差異有統計學意義。M4、M5患者血清AFU活性與外周血單核細胞數的對數呈顯著正相關，提示升高的血清AFU可能來源于單核細胞系統。

3.4 卵巢腫瘤 洪開聽等［8］測定101例婦科各型腫瘤患者及50例健康對照組AFU活性發現，90%的惡性卵巢腫瘤患者血清AFU活性明顯低于婦科其他腫瘤及健康對照組，且與疾病分期、腫瘤負荷、組織學分型和腫瘤分化程度無關。惡性卵巢癌患者血清AFU活性降低可能與遺傳因素有關。以275kU／L為臨界值，據此診斷卵巢惡性上皮癌的敏感性和特異性分別為88.5%和98.5%。因此，AFU也可以作為卵巢癌的一個特異診斷指標。

3.5 健康孕婦 樊國萍［9］測定了177例健康孕婦和69例健康未懷孕對照組的血清AFU活性，并將妊娠組按孕周數不同分為早孕組（1～12周）、中孕組（13～27周）、晚孕組（28～40周）。發現妊娠組與健康未懷孕對照組相比血清AFU水平升高差異有統計學意義（P＜0.01）；比較3組AFU水平發現晚孕組AFU水平高于早、中孕組（P＜0.01，P＜0.05），中孕組高于早孕組（P＜0.05），并伴隨著妊娠周數的增加AFU水平呈升高趨勢，在自然分娩或人工終止妊娠后迅速下降，5d后降至正常。因此，孕婦血清中AFU增高應視為妊娠過程中的特殊生理反應，不同于肝病時的升高，臨床醫生應加以區別。

3.6 糖尿病 權翠俠等［10］對75例糖尿病患者和39例健康者進行了AFU活性測定，發現糖尿病患者AFU水平明顯高于健康對照組，血糖控制差的糖尿病患者其AFU酶活力與同時測定的空服血糖（FBG）和糖化血紅蛋白（HbA1c）存在顯著正相關，而糖控制好的糖尿病患者組AFU酶活力與健康對照組差異無統計學意義，且與FBG和HbA1c不相關。說明糖尿病患者AFU升高與糖代謝控制的好壞有關，糖尿病患者血清AFU明顯高于健康對照組，糖代謝控制差的患者血清AFU與FBG、HbA1c有顯著正相關。這一結果說明糖尿病患者血清AFU可反映HbA1C和FBG所提示的糖代謝控制現狀。

3.7 腹腔積液 段俊林和歐超偉等［11］測定了128例各種病因引起的腹腔積液標本，并按照疾病性質將腹腔積液分成惡性腹腔積液組和良性腹腔積液組。結果顯示，在惡性腹腔積液組中AFU活性均高于良性腹腔積液組，診斷敏感性為80.0%，特異性為87.3%，而且診斷準確率達83.6%，表明AFU活性檢測可作為良、惡性腹腔積液鑒別診斷的一種較好標志物。

3.8 肺部疾病 楊沛等［12］檢測了臨床診斷明確的肺部疾病患者97例，結果顯示，除慢性阻塞性肺疾病患者血清AFU顯著低于健康人及其他肺部疾病患者外，其他肺部疾病患者血清AFU均顯著高于健康人。增高的原因可能與感染、免疫紊亂、蛋白質及脂質代謝異常，以及腫瘤的抗原性密切相關。說明AFU與肺部疾病的發生、發展有密切關系，對肺部疾病的診斷與鑒別診斷具有一定的臨床價值［13－15］。

4 結 語

綜上所述，AFU在原發性肝癌的研究中正日益引起研究者的重視，并且在對肝炎、肝硬化、白血病、卵巢囊腫、糖尿病和肺部疾病的診斷與治療，以及健康孕婦腹腔積液的相關檢測中，AFU都有很高的應用研究價值。所以，繼續探討原發性肝癌患者組織和血清中AFU活性分布規律和升高機制，以及進行AFU同工酶的分離，制備出AFU的抗體及單克隆抗體，有可能使原發性肝癌得臨床診斷與導向治療提供更加有效的手段。

［1］ 王春新，謝國強.血清α－L－巖藻糖的研究及其臨床應用［J］.醫學檢驗進修雜志，1998，5（4）：151－152.

［2］ 葉應嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規程［M］.3版.南京：東南大學出版社，2006：443－444.

［3］ 于秀艷，王文龍，高海燕，等.α－L－巖藻糖苷酶測定方法及在肝癌診斷中的應用［J］.中國實驗診斷學，2001，5（4）：191.

［4］ 勞明，朱波，黃玲莎，等.三種腫瘤標志物聯合檢測對原發性肝癌的診斷價值［J］.中華消化雜志，2005，25（2）：109－110.

［5］ 何謙，劉余靜，趙彩蕾.DEN誘發SD大鼠原發性肝癌形成過程中AFU診斷價值的研究［J］.陜西醫學雜志，2005，34（5）：532－533.

［6］ 張明珠，何廣元，覃強，等.血清α－L－巖藻糖苷酶活性與乙型肝炎相關性研究［J］.寧夏醫學雜志，2007，29（5）：428.

［7］ 趙平，王江濱，張愛國，等.α－L－巖藻糖苷酶對原發性肝癌診斷價值的探討［J］.臨床肝膽病雜志，2003，19（2）：109－110.

［8］ 洪開聽，夏邦世，陳鳳鳳.血清α－L－巖藻糖苷酶對早期原發性肝癌的診斷價值［J］.臨床醫學，2005，25（8）：5－6.

［9］ 樊國萍，周定勇.血清α－L－巖藻糖苷酶在原發性肝癌診斷中的應用［J］.淮海醫藥，2011，29（2）：154.

［10］權翠俠，王慶國，滕曉梅.血清甲胎蛋白、a－L－巖藻糖苷酶、a1－抗胰蛋白酶在原發性肝癌診斷中的應用［J］.醫學檢驗與臨床，2008，19（4）：67.

［11］段俊林，歐超偉.α－L－巖藻糖苷酶的研究進展［J］.國際檢驗醫學雜志，2008，29（8）：731－732.

［12］楊沛，陳偉，石小平.血清α－L－巖藻糖苷酶對原發性肝癌的診斷價值［J］.重慶醫學，2004，33（8）：1174－1175.

［13］張瑞霞，楊義明，趙學峰，等.血清甲胎蛋白、α－L－巖藻糖苷酶和腫瘤相關物質聯合檢測對原發性肝癌的診斷價值［J］.國際檢驗醫學雜志，2006，27（2）111－112，115.

［14］諸天軍.血清α－L巖藻糖苷酶和甲胎蛋白聯合檢測在原發性肝癌診斷中的應用［J］.首都醫藥，2009（16）：39－40.

［15］包廣宇，陸奎英.α－L－巖藻糖苷酶對無機磷測定的干擾及排除［J］.中國醫療設備，2009，24（5）：94.