太湖豬（二花臉）GH、MyoG和H-FABP基因遺傳多態(tài)性分析

邵芳，鮑學凱，馮宇，金星方，丁涵高，顧志良

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500；2.蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇蘇州 215123；3.江蘇省常熟市畜牧獸醫(yī)站，江蘇常熟 215500）

太湖豬（二花臉）GH、MyoG和H-FABP基因遺傳多態(tài)性分析

邵芳1,2，鮑學凱1，馮宇3，金星方3，丁涵高3，顧志良1

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500；2.蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇蘇州 215123；3.江蘇省常熟市畜牧獸醫(yī)站，江蘇常熟 215500）

采用PCR-RFLP方法分析了太湖豬（二花臉）群體中生長激素（growth hormone，GH）、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白（heart fatty acid-binding protein，H-FABP）和肌細胞生成素（Myogenin，MyoG）基因的多態(tài)性.結(jié)果表明：在檢測的二花臉群體中，GH基因經(jīng)DraⅠ、MspⅠ酶切無多態(tài)性，ApaⅠ酶切出現(xiàn)2個等位基因、3種基因型，基因型頻率呈AA＞AB＞BB的趨勢，等位基因A的基因頻率大于等位基因B.MyoG基因在PCR1/MspⅠ位點上，基因型AB占據(jù)一定的優(yōu)勢；在PCR2/MspⅠ位點上，等位基因A占據(jù)絕對的優(yōu)勢，基因型頻率趨勢為AA＞AB＞BB.H-FABP基因的HinfⅠ位點上，等位基因h的基因頻率有一定的優(yōu)勢.經(jīng)χ2適合性檢驗表明，GH、MyoG、H-FABP 3個基因在太湖豬（二花臉）群體中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）.

太湖豬；PCR-RFLP；GH；MyoD；H-FABP

生產(chǎn)性能的最大化及肌肉品質(zhì)的優(yōu)質(zhì)化一直以來都是動物生產(chǎn)者所追求的.動物的生長是由促生長激素軸來調(diào)控的，促生長激素軸中各激素在動物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，其中生長激素（growth hormone，GH）是促進動物生長發(fā)育的主要內(nèi)分泌激素，提高生長軸中GH水平，能促進增重、提高飼料轉(zhuǎn)化率和改善肉品質(zhì)[1].心臟脂肪酸結(jié)合蛋白（heart fatty acid-binding protein，H-FABP）基因是脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty Acid Binding Protein，F(xiàn)ABP）家族成員之一，參與細胞內(nèi)脂肪酸的運輸，對豬的肌內(nèi)脂肪（In?tramuscular fat，IMF）含量影響顯著，被認為是豬肌肉內(nèi)脂肪沉積的主效基因[2-5].肌細胞生成素（Myogenin，MyoG）屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子，是生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族成員之一，在肌細胞的形成過程中起著中心調(diào)控作用[6]，與肌纖維的數(shù)量、大小以及生長分化相關(guān)[7].

太湖豬（二花臉）以繁殖性能高、母性好、耐粗飼和肉質(zhì)鮮美等優(yōu)良特性而著稱于世，是我國寶貴的豬種資源，但生長速度較慢，脂肪含量高.結(jié)合太湖豬（二花臉）豬種的特點，開展其功能基因的結(jié)構(gòu)研究，尋找與快速生長、高瘦肉率、低脂肪率相關(guān)的多態(tài)性位點具有現(xiàn)實意義，能短期內(nèi)實現(xiàn)豬種的改良，從而提高經(jīng)濟效益.鑒于GH、H-FABP和MyoG基因在調(diào)控生長、改善肌肉品質(zhì)方面的重要作用，本研究利用PCR-RFLP技術(shù)，對太湖豬GH、H-FABP和MyoG這三個功能基因進行多態(tài)性研究，進一步作群體遺傳學分析，以期對太湖豬（二花臉）相應基因的功能和群體遺傳學結(jié)構(gòu)有更加全面的認識.

1 材料與方法

1.1 試驗動物與樣品采集

從常熟市畜禽良種有限責任公司采集太湖豬（二花臉）保種群95個個體的耳組織，放入裝有75%乙醇的1.5 m L離心管中，于-20℃保存?zhèn)溆?

1.2 耳組織DNA的提取

基因組DNA的提取方法詳見分子克隆實驗指南，提取的DNA樣品用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，NanoDrop2000（Thermo Scientific，USA）測定其濃度，用TE稀釋成100 ng/μL，放于-20℃冰箱備用.

1.3 引物設計與合成

實驗所用引物參照相關(guān)文獻設計[8-10]，引物序列、產(chǎn)物長度、退火溫度等詳細信息見表1.引物均由上海生工生物工程有限公司合成.

1.4 PCR反應體系與反應條件

PCR反應體系為25μL：2.5μL 10×Buf?fer，2μL dNTP Mix?ture（2.5 mmol/L），1μL上游引物（10 pmol/L），0.2μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL），1μL DNA模板（100 ng/ uL），17.3μL ddH2O.反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 sec，57℃退火30 sec，72℃延伸1 m in，35個循環(huán)；72℃延伸10 m in．PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果.

1.5 PCR-RFLP檢測

分別用限制性內(nèi)切酶ApaⅠ、DraⅠ、MspⅠ消化GH基因PCR擴增產(chǎn)物，酶切體系為15μL：10×buffer 2.0μL，限制性內(nèi)切酶1.0μL（10 U/μL），PCR產(chǎn)物5.0μL，ddH2O 7.0μL，置37℃恒溫水浴中反應4 h．MyoG和H-FABP酶切體系同GH基因.最后根據(jù)酶切片段大小，使用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳、基因型分型.

表1 PCR引物的信息

1.6 遺傳統(tǒng)計方法

基因頻率：基因頻率＝某基因總數(shù)/等位基因的總數(shù).

基因型頻率：基因型頻率＝基因型個體/測定群體總數(shù).

基因純合度（Homozygosity，Ho）的計算公式如下：

雜合度（Heterozygosity，He）的計算公式如下：

有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles，Ne）的計算公式如下（其中：n為等位基因數(shù)；Pi為第i個等位基因的頻率）：

多態(tài)信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）的計算公式如下（其中：k為等位基因數(shù)目；Pi和Pj分別為第i和第j個等位基因的頻率）：

Hardy-Weinberg平衡檢驗的計算公式如下（其中，Oi為實際觀察值；Ei為理論值；n為等位基因數(shù)）：

2 結(jié)果與分析

2.1 二花臉豬GH基因PCR-RFLP檢測

以二花臉豬基因組為模板，引物SusGH F/R進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（見圖1A），結(jié)果顯示，獲得長度為576 bp的PCR擴增產(chǎn)物.GH基因的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)ApaⅠ酶切后產(chǎn)生2個等位基因A（434+142）bp和B（302+274）bp；3種基因型[8]（見圖1B），即AA型（434 bp，142 bp）、AB型（434 bp，274 bp，142 bp）和BB型（302 bp，274 bp）.GH基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ（圖1C）和DraⅠ（圖1D）酶切后僅產(chǎn)生一種基因型，即95個個體全為AA型.

2.2 二花臉豬MyoG基因PCR-RFLP檢測

以太湖豬基因組為模板，分別用引物SusMyoG F1/R1、SusMyoG F2/R2進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2A，2B所示.MyoG基因的F1/R1擴增產(chǎn)物片段長度為959 bp，位于外顯子2、3及內(nèi)含子2，經(jīng)MspⅠ限制性內(nèi)切酶酶切電泳后（見圖2C），出現(xiàn)5條帶，分別為418 bp、370 bp、264 bp、171 bp、154 bp.定義（370+264+171+154）bp為等位基因A，（418+370+171）bp為等位基因B[9].MyoG基因的F2/R2擴增產(chǎn)物片段長度為353 bp，位于3’端側(cè)翼序列，經(jīng)MspⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生兩個等位基因A（353 bp）和B（219+134）bp，根據(jù)條帶的數(shù)目和位置，確定有3種基因型（圖2D），分別為AA基因型（353 bp）、AB基因型（353 bp，219 bp，134 bp）、BB基因型（219 bp，134 bp）[9].

2.3 二花臉豬H-FABP基因PCR-RFLP檢測

H-FABP基因經(jīng)PCR擴增后獲得長度為693 bp的PCR擴增產(chǎn)物（見圖3A），HinfⅠ酶切結(jié)果見圖3B，共有4個HinfⅠ酶切位點.PCR-RFLP結(jié)果如圖3B所示，根據(jù)條帶的數(shù)目和位置，確定有3種基因型，分別為HH基因型（339 bp，172 bp，98 bp，59 bp，25 bp），Hh基因型（339 bp，231 bp，172 bp，98 bp，59 bp，25 bp），hh基因型（339 bp，231 bp，98 bp，25 bp）[10].

2.4 二花臉豬GH、MyoG、H-FABP基因的等位基因頻率和基因型頻率

圖1 GH基因PCR-RFLP檢測結(jié)果

由表2可知，對于GH基因，太湖豬以AA基因型為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.5368，其次是AB基因型，BB型基因頻率最低，等位基因A為優(yōu)勢基因，基因頻率為0.7105．MyoG基因PCR1/MspⅠ多態(tài)性位點不同基因型頻率呈現(xiàn)趨勢為AB＞AA＞BB，等位基因A與B基因頻率相差不大.MyoG基因PCR2/MspⅠ酶切位點，以AA基因型為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.7363，其次是AB基因型，BB型基因頻率最低，僅為0.0211.等位基因A為優(yōu)勢基因，基因頻率為0.8526.太湖豬H-FABP基因，以Hh基因型為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.5369，其次是hh基因型，HH型基因頻率最低，僅為0.0947.等位基因h為優(yōu)勢基因，基因頻率為0.6368.

2.5 GH、MyoG和H-FABP基因的群體遺傳特性分析

群體遺傳分析表明（見表3）：太湖豬GH、MyoG和H-FABP基因純合度均大于雜合度.其中MyoG基因片段2純合度最高，為0.7487，GH和H-FABP基因純合度與雜合度差異不明顯.MyoG基因片段2多態(tài)性信息含量PIC＜0.25，為低度多態(tài)；GH、MyoG片段1和H-FABP基因PIC均在0.25～0.5之間，為中度多態(tài).Har?dy-Weinberg平衡適合性檢驗結(jié)果表明：太湖豬這幾個功能基因χ2值均小于5.99，說明均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）.

圖2 MyoG基因PCR-RFLP檢測結(jié)果

表2 GH、MyoG、H-FABP基因的基因型和基因頻率

表3 太湖豬GH、MyoG、H-FABP基因純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量和Ha rdy-W einberg平衡狀態(tài)檢驗

3 討論

3.1 GH基因?qū)ωi生長性能的影響

豬生長激素基因（pGH）是促進其生長發(fā)育的主效基因，該基因存在多種酶切位點，有較豐富的限制性片段長度多態(tài)性（RFLP），與生長發(fā)育、胴體性狀等生產(chǎn)性能相關(guān)[11].pGH基因ApaⅠ是目前研究較多的功能位點，該片段G→A多肽位點，導致ApaⅠ酶切出現(xiàn)2個等位基因、3種基因型，不同品種間表現(xiàn)差異[8，12-13].宋成義等人研究發(fā)現(xiàn)GH基因ApaⅠ識別的多態(tài)位點的不同基因型對姜曲海豬的70日齡體重影響差異顯著，認為該處突變可能對GH基因的表達產(chǎn)生影響[13].胡尚等人研究高坡豬GH基因?qū)ζ洳糠稚a(chǎn)性能的影響發(fā)現(xiàn)，AA基因型的腹圍和瘦肉率與BB基因型相比差異顯著.本研究發(fā)現(xiàn)太湖豬（二花臉）等位基因A（0.7105）的頻率明顯高于等位基因B（0.2895），AA型為優(yōu)勢基因型，這與皮特蘭、杜洛克、長白、香豬、南昌白豬研究結(jié)果一致[14].太湖豬群體中GH基因MspⅠ酶切后不同于藏豬、皮特蘭、杜洛克和姜曲海豬[13]，沒有多態(tài)性.

3.2 MyoG基因?qū)ωi部分生長性狀的影響

SoumilIion等用PCR-RFLP檢測MyoG基因，發(fā)現(xiàn)一個MspⅠ酶切位點位于基因的3’-UTR區(qū)，一個位于第2內(nèi)含子內(nèi)，另一個梅山豬特異性MspⅠ酶切位點位于啟動子內(nèi)[15].前人研究認為MyoG基因3’端MspⅠ位點不同等位基因?qū)﹄伢w品質(zhì)和肉質(zhì)性狀的遺傳效應主要體現(xiàn)在與肌肉相關(guān)的各種生產(chǎn)性狀上，不同基因型對不同生產(chǎn)性能的影響存在巨大的差異.大量的研究已經(jīng)證明，A基因是外種豬群體中的優(yōu)勢等位基因，而大多數(shù)中國地方豬種中的優(yōu)勢基因則是等位基因B[16].朱礪等分析了不同品種豬MyoG基因3’端MspⅠ位點多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)等位基因B能極顯著地增加胴體瘦肉率和眼肌面積，降低皮脂含量，同時還能顯著降低豬肉品質(zhì)，使pH值、肉色和肌肉內(nèi)脂肪含量降低，使肌肉吸水能力變差[17].林萬華等研究報道，第2內(nèi)含子內(nèi)MspⅠ酶切位點上，外來品種杜洛克、長白、大約克及培育品種南昌白豬極大多數(shù)個體表現(xiàn)為AA型，個別為BB型，而6個中國地方豬種除樂平花豬外，BB型占優(yōu)勢[18]，本實驗研究發(fā)現(xiàn)太湖豬（二花臉）內(nèi)含子2 MspⅠ酶切位點，基因型頻率呈AB＞AA＞BB的趨勢，等位基因A的頻率與等位基因B差異不大.在3’端MspⅠ位點，太湖豬（二花臉）基因型頻率呈AA＞AB＞BB的趨勢，等位基因A（0.8526）的頻率是等位基因B（0.1474）的近6倍，這與前人所報道的中國地方豬種幾乎表現(xiàn)為單一的MM基因型檢測結(jié)果不一致[9,18].

3.3 H-FABP基因?qū)ωi相關(guān)性狀的影響

Gerbens等對H-FABP基因的單核苷酸多態(tài)性位點進行檢測，發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點定位于H-FABP基因的5’上游區(qū)，由限制性內(nèi)切酶HinfⅠ識別.高妍等人發(fā)現(xiàn)HinfⅠ多態(tài)性在所檢測的7個豬種中普遍存在，且松遼黑豬H-FABP基因的遺傳變異對IMF含量的影響極顯著（P＜0.01），表現(xiàn)趨勢為HH＞Hh＞hh，三種基因型差異極顯著（P＜0.01）[10].林萬華等人基于候選基因分析H-FABP基因?qū)∪獯种竞康挠绊懙贸銎浔憩F(xiàn)趨勢為HH＞Hh＞hh[19].而本研究中，太湖豬（二花臉）H-FABP不同基因型頻率呈現(xiàn)Hh＞hh＞HH的趨勢，等位基因h為優(yōu)勢基因.

本試驗對太湖豬（二花臉）群體GH、MyoG、H-FABP基因多態(tài)性作了初步的分析，今后還需要通過擴大品種和樣本數(shù)量進一步研究GH、MyoG、H-FABP基因的多態(tài)性，同時，記錄不同品種不同個體的經(jīng)濟性狀，進一步分析基因多態(tài)性與豬生產(chǎn)性能的關(guān)系.

圖3 H-FABP基因PCR-RFLP檢測結(jié)果

[1]顧志良，王慧娟，郁建鋒.動物GH/IGF-Ⅰ軸調(diào)控機制的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（10）.

[2]Gerbens F,de Koning D J,Harders F L,et al.The effect of adipocyte and heart fatty acid-binding protein genes on intramuscular fatand backfat content in Meishan crossbred pigs[J].JAnim Sci,2000,78(3):552-559.

[3]Gerbens F,Verburg F J,Van Moerkerk H T,et al.Associations of heart and adipocyte fatty acid-binding protein gene expression with intramuscular fat content in pigs[J].JAnim Sci,2001,79(2):347-354.

[4]LiB,Zerby H N,Lee K.Heart fatty acid binding protein is upregulated during porcine adipocyte development[J].JAnim Sci,2007, 85(7):1651-1659.

[5]ArnyasiM,Grindflek E,Javor A,et al.Investigation of two candidate genes formeat quality traits in a quantitative trait locus region on SSC6:the porcine short heterodimer partner and heart fatty acid binding protein genes[J].JAnim Breed Genet,2006,123(3):198-203.

[6]Weintraub H, Davis R, Tapscott S, et al. The myoD gene family: nodal point during specification of the muscle cell lineage[J]. Sci?ence, 1991, 251(4995): 761-766.

[7]Sabourin L A,RudnickiM A.Themolecular regulation ofmyogenesis[J].Clin Genet,2000,57(1):16-25.

[8]張浩，強巴央宗，張明明，等.藏豬生長激素基因（p GH）多態(tài)性研究[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2010，19（2）：5.

[9]趙青，鐘土木，徐寧迎.金華豬MyoG基因多態(tài)性與部分生長性能的關(guān)系[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2010，31（2）.

[10]高妍，張永宏，姜寧，等.豬H-FABP基因遺傳多態(tài)性及與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)分析[J].中國獸醫(yī)學報，2008，28（5）：5.

[11]Cheng W T,Lee C H,Hung CM,et al.Growth hormone gene polymorphisms and growth performance traits in Duroc,Landrace and Tao-Yuan pigs[J].Theriogenology,2000,54(8):1225-1237.

[12]趙麗莉，聶光軍，郭曉令，等.金華豬生長激素基因的多態(tài)性及其對經(jīng)濟性狀的影響[J].中國畜牧雜志，2006，42（5）：4.

[13]宋成義，經(jīng)榮斌，陶勇，等.豬GH基因部分突變位點對生產(chǎn)性能的影響[J].遺傳，2001，23（5）：4.

[14]Song C Y,Gao B,Jing R B,et al.Study on pig growth hormone gene polymorphisms in western meat-type breeds and Chinese lo?calbreeds[J].JZhejiang Univ Sci,2003,4(6):734-739.

[15]Soumillion A,Erkens JH,Lenstra JA,etal.Genetic variation in the porcinemyogenin gene locus[J].Mamm Genome,1997,8(8): 564-568.

[16]te PasM F,Soumillion A,Harders F L,etal.Influences ofmyogenin genotypes on birth weight,growth rate,carcassweight,back?fat thickness,and lean weightof pigs[J].JAnim Sci,1999,77(9):2352-2356.

[17]朱礪，李學偉.MyoG基因的遺傳效應分析[J].遺傳，2005，27（5）：5.

[18]林萬華，黃路生，艾華水，等.MyoG基因型對二花臉豬早期生長性狀及肌肉組織學特性的影響[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2002，10（4）：6.

[19]林萬華，任軍，丁能水，等.H-FABP基因型對二花臉豬相關(guān)性狀影響的初步分析[J].畜牧獸醫(yī)學報，2003，34（4）：7.

Polymorphisms of GH、MyoG、H-FABP Gene in Taihu Pigs

SHAO Fang1,2,BAO Xue-kai1,FENG Yu3,JIN Xing-fang3,Ding Han-gao3,GU Zhi-liang1
(1.School of Biology and Food Technology,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China; 2.College of Basic Medicine and Biological Science,Soochow University,Suzhou 215123,China; 3.Animal Husbandry and Veterinary Station of Changshu,Changshu 215500,China)

PCR-RFLP was used to analyze the polymorphisms of GH、MyoG and H-FABP gene in Taihu pigs. The results showed that there were no polymorphisms at DraⅠand MspⅠsite,while there were 2 alleles,3 gen?otypes(AA,AB and BB)at ApaⅠsite of GH gene.The genotype frequencies of GH gene had a tendency of AA＞AB＞BB.The frequency of allele B wasmuch higher than A in GH gene.The polymorphisms of two frag?ments of MyoG digested by MspⅠwere detected.The polymorphisms at PCR1/MspⅠshowed AB genotype were predom inant.In PCR2-/MspⅠsites,allele A occupied absolute advantage,the genotype frequencies of MyoG gene had a tendency of AA＞AB＞BB.In the H-FABP HinfⅠsites,allele h with 0.6368 was advantageous com?pared with allele H.According to the calculated chi-square value,it verified that three genes were all consistent with the Hardy-Weinberg equilibrium(P＞0.05).

Taihu pig;PCR-RFLP;GH;MyoG;H-FABP

S828.8

A

1008-2794（2012）08-0055-06

2012-05-25

常熟市科技（社會發(fā)展）計劃項目“太湖豬（二花臉）基因庫的活體保存與利用”（CS201010）

邵芳(1989—)，女，江蘇建湖人，蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院碩士研究生．

顧志良（1968—），男，江蘇常熟人，教授，博士，研究方向：動物分子遺傳學，E-mail:zhilianggu88@hotmail.com．