苣荬菜中木犀草素的檢測(cè)方法研究＊

楊智峰 李彤暉 蒙麥俠 辛智科 陜西省中醫(yī)藥研究院（西安710003）

苣荬菜是陜西地方習(xí)用藥材“北敗醬”的主要來(lái)源，1977年版《中國(guó)藥典》一部收載過(guò)。在陜西分布廣、產(chǎn)量大，干燥幼嫩全草臨床主要用于治療闌尾炎、腸炎、痢疾，瘡癤癰腫，產(chǎn)后瘀血腹痛和痔瘡。多年來(lái)一直缺乏切實(shí)可靠的檢測(cè)手段，使市場(chǎng)監(jiān)管和臨床用藥安全有效保障乏力，為此，我們研究了其中木犀草素的富集方法和檢測(cè)方法。

1 儀器和試藥 1.1 儀器 高效液相色譜儀（LC－2010AHT型，日本島津），CLASS－VP色譜數(shù)據(jù)工作站；電子分析天平（型號(hào)：BP211D，d＝0.01mg，德國(guó)賽多利斯天平有限公司）；超聲波清洗器（型號(hào)：KQ－100，昆山市超聲儀器有限公司）；UV－8型三用紫外儀（無(wú)錫科達(dá)分析儀器廠）。

1.2 試藥 乙腈為色譜純，購(gòu)自陜西科儀科技有限公司；水為純凈水；三氯化鋁、甲醇、甲酸、三氯甲烷、丙酮、氨水和冰乙酸均為分析純。木犀草素對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)111720－200905，購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所）；聚酰胺－6薄層板（浙江四青或國(guó)藥集團(tuán)）；樣品北敗醬1＃采自陜西太白縣（2009.07.16），2＃采自陜西太白縣（2006.07.10），3＃購(gòu)自甘肅天水（2004.04.17），4＃購(gòu)自西安市萬(wàn)壽路藥材市場(chǎng)，5＃購(gòu)自陜西寶雞市（2005.08.30），6＃購(gòu)自甘肅（2004.04.16），7＃來(lái)自西安盛興飲片廠（2008.09.12），8＃來(lái)自華陰勝福中藥飲片廠（2005.10.12），9＃陜西省食品藥品檢驗(yàn)所（2011.07.19）。

2 方法與結(jié)果 2.1 目標(biāo)成分富集和薄層鑒別方法 取本品粉末10.0g，置具塞錐形瓶中，加石油醚（60～90℃）浸泡1h，回流兩次，依次加石油醚100和80mL，每次回流1h，放冷，過(guò)濾，濾液棄去，濾渣揮干，加甲醇浸泡1h，回流2次，依次加甲醇100和80mL，每次1h，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘留物用15～20mL溫水溶解，上聚酰胺柱（柱高15～17cm，內(nèi)徑1.4cm），60mL水洗（可加壓），洗脫液棄去，體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇60mL洗，洗脫液棄去，體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇80mL洗，洗脫液棄去，體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇80mL洗，洗脫液蒸干，用甲醇1.6mL使溶解，作為供試品溶液。另取木犀草素對(duì)照品適量，加甲醇制成1mL含木犀草素1.5mg的對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010版一部附錄ⅣB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各0.5μL，點(diǎn)于同一聚酰胺－6薄層板（浙江四青或國(guó)藥集團(tuán)）上，以甲醇－丙酮－－冰乙酸（12︰5︰0.8）為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴50g·L－1三氯化鋁乙醇液，氨氣薰蒸，日光下或置紫外燈（365nm）下檢視。供試品色譜與對(duì)照色譜在相應(yīng)的位置上有相同的黃色或黃綠色斑點(diǎn)。或吸取上述兩種溶液各1.5μL，點(diǎn)于同一以0.25%的CMC－Na為黏合劑的硅膠G板上，以氯仿－甲醇－甲酸（18︰3︰0.8）為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴50g·L－1三氯化鋁乙醇液，氨氣薰蒸，置日光下或紫外燈（365nm）下檢視。供試品色譜與對(duì)照色譜在相應(yīng)的位置上有相同的暗黃色或黃綠色斑點(diǎn)。

2.2 含量測(cè)定方法 2.2.1 色譜條件：Lichrosper C18色譜柱（250×4.6mm，5μm），柱溫：35℃，流動(dòng)相：乙腈－0.4%磷酸（24：76），流速：1mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)：348nm，進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取木犀草素對(duì)照品3.93mg，加甲醇定容于25mL量瓶中，制成每1mL含0.1572mg的儲(chǔ)備溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備：取北敗醬藥材細(xì)粉約2.0g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱(chēng)質(zhì)量，超聲處理40min，取出，放涼，稱(chēng)質(zhì)量，用甲醇溶液補(bǔ)足質(zhì)量，過(guò)濾。精密吸取續(xù)濾液10mL，置圓底燒瓶中，精密加鹽酸1mL，稱(chēng)質(zhì)量，加熱回流2h，放冷，稱(chēng)質(zhì)量，用甲醇溶液補(bǔ)足重量，過(guò)濾，以0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 分離效果：在上述色譜條件下，分別吸取稀釋10倍的對(duì)照品儲(chǔ)備液和樣品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，可見(jiàn)木犀草素分離效果良好（見(jiàn)圖）。

高效液相色譜圖 A 對(duì)照品；B 供試品；1 木犀草素

2.2.5 方法學(xué)考察：2.2.5.1 線性關(guān)系考察：精密吸取稀釋10倍量后的木犀草素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（0.01572mg·mL－1）2、4、6、8、10、12μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)對(duì)進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝2000000 X＋39506，r＝0.9995。結(jié)果表明：在0.0314～0.1886μg范圍內(nèi)，對(duì)照品峰面積值與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5.2 樣品處理之超聲時(shí)間考察：分別稱(chēng)取北敗醬藥材（2009.07.16）約2.0g，3份，超聲處理分別為：30、40和50min，其余按2.2.3方法和2.2.4方法進(jìn)行。結(jié)果表明：超聲40min，藥材中木犀草素的提取量最大且隨時(shí)間推移提取量不再增加，說(shuō)明藥材中的木犀草素已提取完全，故確定之。

2.2.5.3 樣品處理之鹽酸用量考察：分別稱(chēng)取北敗醬藥材（2009.07.16）約2.0g 3份，精密加鹽酸分別為1、2和4mL，其余按2.2.3方法和2.2.4方法進(jìn)行。結(jié)果表明：加入鹽酸量1mL時(shí)，藥材中木犀草素的提取量最大且隨酸度增加不再增加，故確定之。

2.2.5.4 精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液和供試品（2009.07.16）溶液各10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD分別為1.83%，0.50%。對(duì)照品和樣品的精密度良好。

2.2.5.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密稱(chēng)取北敗醬藥材（2009.07.16）約2.0g，按2.2.3方法進(jìn)行，即得供試品溶液。分別在0、2、4、8、12和24h，吸10μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算RSD為0.35%。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5.6 回收率實(shí)驗(yàn)：稱(chēng)取已知含量的北敗醬藥材（含量0.01629%）約1.0g，6份，精密稱(chēng)取，均精密加入木犀草素對(duì)照品溶液（C標(biāo)＝0.1572mg·mL－1）1mL，下按2.2.3方法和2.2.4方法進(jìn)行。數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，結(jié)果表明：回收率在95% ～105%之間，平均回收率為101.32%，說(shuō)明該方法測(cè)定系統(tǒng)響應(yīng)性好。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （Results of recovery test）

2.2.5.7 樣品測(cè)定：分別精密稱(chēng)定不同來(lái)源的北敗醬藥材2.0g，共8份，下按2.2.3方法和2.2.4方法進(jìn)行，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同來(lái)源的北敗醬的含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論 苣荬菜在東北用于虛弱咳嗽［1］，在河南用于乙型肝炎［2］，大家在歸經(jīng)方面缺乏共識(shí)，有人認(rèn)為歸肝、脾、大腸經(jīng)［3－4］；在清濕熱、消腫排膿和化瘀解毒功效［5－6］上大家認(rèn)識(shí)趨于一致，有人對(duì)化瘀排膿存疑，認(rèn)為用于產(chǎn)后瘀血腹痛效果不佳［7］。

從薄層分析實(shí)驗(yàn)看，苣荬菜中含有游離木犀草素，也有木犀草素苷類(lèi)，因此，酸解法測(cè)定木犀草素含量，應(yīng)為苷元和苷總含量，與文獻(xiàn)報(bào)道［8－9］一致。

從樣品含量測(cè)定結(jié)果結(jié)合藥材性狀，建議藥材中的木犀草素含量應(yīng)規(guī)定在0.018%以上，否則為劣藥，當(dāng)然與測(cè)定方法的精度有關(guān)。

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