關于“使用血球計數板對酵母菌進行計數”的問題探討

丁傅

摘要：“培養液中酵母菌種群數量的動態變化”是新課標教材“必修3：穩態與環境”中的學生分組實驗，需要學生學會使用血球計數板進行準確計數酵母。通過結合“培養液中酵母菌種群數量的動態變化”這一實驗和有關血球計數板的命題的分析，對血球計數板的計數原理和操作方法中遇到一些問題進行探討。

關鍵詞：血球計數板 生物學實驗 實驗操作

中圖分類號：G633.91

文獻標識碼：B

在人教版高中生物教材中，“探究培養液中酵母菌種群數量變化”只作了基本的原則性指導，對一些操作過程的細節，沒有作細化闡述，而這些細節都是實驗成功的關鍵所在。

如何正確使用血球計數板對酵母菌種群數量進行計數，是本實驗的重點和難點。根據中學實驗條件，用顯微鏡直接計數法相對容易，只要指導學生掌握血球計數板的正確使用便可。但學生對血球計數板結構的認識不夠明確，教師也講解不清晰。而在近年來的高考題或模擬題中多次出現相關的試題，而且不僅從如何計算酵母的數量的角度來考查學生，還從操作方法或操作過程中出現的一些問題以及處理方法來考查學生。而教師在遇到這些問題往往讓學生記答案，學生對這些問題仍是感到疑惑。筆者在近年來的教學實踐中，將教師和學生在做該實驗和相關命題遇到的一些問題，進行了分析探討。

1 血球計數板的構造和計數原理

雖然不同版本的教材推薦使用的血球計數板的規格不同，人教版建議使用2mmx2mmx0.1mm方格，蘇教版推薦使用1mmx1mmx0.1mm方格，但是血球計數板的使用原理和方法是相同的。以下以1mmx1mmx0.1mm方格的計數板為例分析結構和計數原理。

每個血球計數板上有兩個計數室（圖1）。血球計數板上的符號和數字（圖1）的含義是：XB-K-25為計數板的型號和規格，表示此計數板中計數室分25個中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計數室的高；1/400mm²表示計數室面積是1mm²（計數室邊長1mm），分400個小格，每小格面積是1/400mm²（圖2），9個大方格中只有中間的有小方格的中央大方格才是計數室。不要認為9個大方格都是計數室。

計數室通常也有兩種規格：一種是16x25型，即大方格內分為16中格，每一中格又分為25小格（圖2）；另一種是25x16型，即大方格內分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計數室是哪一種構造，它們都有一個共同的特點，即每一大方格都是由16x25=25x16=400個小方格組成。

計數時，若計數室是由16個中方格組成，數左上、左下、右上、右下的4個中方格（即100個小方格）的菌數。如果是由25個中方格組成的計數室，除數上述4個中方格外，還需數中央1個中方格（即80個小格方）的菌數（圖3）。計數時對壓在中格四條線上的細胞只計數相鄰兩邊及其夾角上的細胞（一般選左邊和上邊的線）。

以1minx1mmx0.1 mm方格的計數板為例，如果是25個中格的計數室，計數的5個中格菌數共N個，那么1mL培養液中菌數=N/5x25x10000x稀釋倍數。如果是16個中格的計數室，計數的4個中格菌數共N個，那么1mL培養液中菌數=N/4x16x10000x稀釋倍數。

2 血球計數板操作方法的注意事項

教師在介紹血球計數板的操作方法時，往往是比較簡略的。學生在操作中因為對操作要求不理解而造成操作不當，或者對操作中出現的異常問題的處理不知如何處理。而通過分析近幾年的有關血球計數板的相關試題，更注重操作方面的考查，而教師在這方面對學生分析闡述得少。

（1）在取樣計數前，為什么要將酵母菌培養液進行振蕩搖勻？

因為這樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀，提高計數的代表性和準確性，減小培養液中的酵母菌數量誤差。

（2）為什么要先在計數室上蓋上蓋玻片，再滴加菌液？

通常滴加菌液時，采用的是“滲入法”：先將蓋片蓋住計數室，蓋片的兩端應搭放在計數室兩側的支持柱上。從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（不宜過多，一般將滴管口沿蓋片邊緣與計數平臺之間的空隙輕輕靠一靠即可），讓菌懸液滲入并充滿計數室，勿使氣泡產生，并用吸水紙吸去多余菌液。技巧：用吸水紙吸去多余的培養液時要迅速，保證計數室被培養液充滿，以減少誤差。

但也可采用“壓滴法”：先將適量菌液滴加在計數平臺上，再將蓋片從一側壓到計數扳上，使蓋片搭放在兩則支持柱上，將菌液滴壓平。不管用哪種方法，都必須把握3個原則：加入待測菌液后，計數室內不能產生氣泡；不能將菌懸液沾到蓋玻片表面，以免污染顯微鏡的高倍鏡頭；不能將菌液沾到計數平臺兩側的支持柱表面。比較而言，滲入法更容易操作。

（3）如果先滴加菌液，再加蓋玻片，容易出現什么誤差？怎么處理？

如果先滴加菌液，再加蓋玻片（壓滴法），容易使菌液沾到計數平臺兩側的支持柱表面，在支持柱表面形成一層水膜而使蓋片不能完全落在支持柱上。蓋玻片由于液滴的表面張力作用而未能嚴密的蓋到計數板表面上，使計數室內的體積增大，計數結果將偏高。應將血球計數板和蓋玻片洗凈、烘干重做。

（4）如果計數室中出現氣泡，會出現什么誤差？怎么處理？

如果計數室中出現氣泡，會使蓋玻片下有部分空間沒有充滿菌液，是待計數的菌液體積減少，導致結果偏小。應將血球計數板和蓋玻片洗凈、烘干重做。也就要重新制片。

為什么不采用在蓋玻片一側滴加菌液，另一側用吸水紙吸引的“引流法”？這是因為通過引流法，將蓋玻片下方的液體可以進行置換，可能會去除部分氣泡，但很難除盡氣泡。引出的菌液會帶走部分細胞，造成誤差。菌液也容易沾到蓋玻片表面，污染顯微鏡的高倍鏡頭而看不到目標。

（5）血球計數板應該如何正確清洗？

血球計數板使用結束后，應采用清水浸泡和沖洗的方式清洗，并進行烘干或自然晾干或用吹風機吹干。不能使用試管刷等硬物進行擦洗。鏡檢每個小格中是否存有污物、殘菌，如不清潔，需重新清洗直至潔凈。

這是因為血球計數板的方格線非常精細、脆弱，當用試管刷擦洗時會造成線條磨損。也不能用普通的餐巾紙等進行拭擦，可能磨損線條，也會在計數室中留下紙纖維等污物。要用專用的拭鏡紙輕輕擦拭。另外在使用血球計數板前需要在顯微鏡下檢查，不干凈要清洗烘干再使用。

（6）使用顯微鏡下進行計數，要注意哪些問題？

①血球計數板加樣后，需靜置片刻再使用顯微鏡計數。這是因為計數室中的菌懸液有一定的高度（0.1mm）。需要讓細胞沉降到計數室底部的網格線中，避免細胞分布在不同液層深度，導致計數時被遺漏。

②先在低倍鏡下，找到網格，也就是要先找到計數室（有小網格的部分）。將第一個計數中格移到視野中心，再換高倍鏡逐小格觀察并計數。觀察時還應安排一個順序，比如，依次按照左上中格、左下中格、右下中格、右上中格。若有第五中格時，當計數到右上中格時，先向左移動兩個中格，再往下移動兩個中格便是最中間的一個中格。小格的觀察順序最好是從左到右，從上到下逐格進行。計數時壓線的細胞本著計上不計下，計左不計右的原則，以免重復計數。

活酵母有芽殖現象，若芽體達到母細胞大小的一半時，即可作為兩個菌體計數；若芽體小于母細胞一半時為一個酵母細胞。

③因為生活酵母細胞的折光率和培養液的折光率相近，所以觀察時要減弱光照的強度，將視野調暗些。但不能太暗，否則也看不清。

④每個樣品計數應重復3次（每次數值不應相差過大，否則應重新操作），取其平均值。

（7）如果細胞數目過多，難以數清，應該采取什么措施？

如果一個小方格內酵母菌過多，難以數清，應該進行稀釋，然后再進行計數。一般樣品稀釋度要求每小格內約有5～10個菌體為宜。

稀釋時要注意：將1mL樣液稀釋10倍，不是加10mL無菌水，而是加9mL無菌水，即加水稀釋后的體積是原來的10倍。這點不仔細就很容易分析錯。例如將1mL樣液稀釋100倍，就應該加99mL水。而不是90mL水。

（8）能不能區分活酵母細胞和死酵母細胞，避免計數出現較大誤差？

探究“酵母菌種群數量變化”，理應為培養液中活菌體的數量變化，人教版教材中沒有提出活菌和死菌的分開計數問題。易理解成用總的菌體數作計數結果；蘇教版教材中雖建議用臺酚藍染液染色，但沒有說明這是對活菌（無色）和死菌（藍色）的區分，并且是將染液直接滴在血球計數板上，菌液濃度改變，造成誤差。正確的做法應是另外制作裝片，通過染色對活菌和死菌加以區分，算出兩者比例，進一步換算出總菌體數中的活菌數。由于臺酚藍染液配制相對復雜，且臺酚藍有一定致癌性，建議用呂氏堿性美藍（亞甲藍）染液對酵母菌染色，活的酵母細胞呈無色，死的或代謝衰弱的酵母細胞呈藍色。