XAF1蛋白在人肝癌組織中的表達及術后復發中的作用研究

王建軍 洪來電 余爭垚

[摘要] 目的 XIAP相關因子1（XIAP-Associated Factor 1，XAF1）可與XIAP直接結合并拮抗其抗凋亡作用，本文研究了XAF1在人肝細胞癌組織中的表達，并探討了其在肝癌患者預測復發中的價值。 方法 采用免疫組化法檢測38例HCC患者肝癌組織中XAF1蛋白的表達，并分析其與術后復發的關系。 結果 XAF1在人肝癌組織中表達免疫組化實驗結果提示，XAF1在人肝癌組織中的表達陽性率為36.84%（14/38），在癌旁正常組織中的表達陽性率為100%（38/38），兩者差異有統計學意義（P＜0.05）。24例XAF1低表達患者中，XAF1表達水平與PVTT（P=0.012）、AFP高水平（P=0.016），腫瘤大小（P=0.037）有關；Log-rank檢驗結果顯示，XAF1低表達患者的術后1年無瘤生存率顯著低于XAF1正常表達患者（P＜0.05），是影響HCC術后1年生存率的因素之一。 結論 XAF1在人體肝癌組織中表達水平低于癌旁正常組織，這可能是影響肝癌術后復發的一個潛在危險因素。

[關鍵詞] XIAP相關因子1；肝腫瘤；復發

[中圖分類號] R735.7[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）01-001-02

Role of XAF1 in tumor recurrence of patients with hepatocellular carcinoma treated with hepatectomy

WANGJianjun HONGLaidian YUZhengyao

Department of General Surgery, Chun'an County First People's Hospital, Chun'an 311700, China

[Abstract] Objective XIAP-associated factor 1 (XAF1) is a putative tumor suppressor that exerts its proapoptotic effects through both caspase-dependent and–independent means. In this study we investigated the expression XIAP-associated factor 1 (XAF1) in human hepatocellular carcinoma (HCC) and its mechanism of post-surgical recurrence of patients with HCC. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of XAF1 in 38 patients with HCC after hepatectomy, and the relationship between the expression of XAF1 and the post-surgical recurrence of patients with HCC was analyzed by bioinformatics. Results Immunohistochemisitry results showed that the positive ratio was 36.84% (14/38) and 100% (38/38) in human HCC tumor tissues and corresponding normal liver tissues significantly, and there was significant difference between them (P＜0.05). HCC patients with low expression of XAF1 were associated with PVTT (P=0.012), highalpha-fetoprotein (AFP) level (P=0.016) and tumor size (P=0.037) , respectively. It was demonstrated that the 1-year tumor-free survival rate of normal XAF1 expression patients was significantly higher than that of low XAF1 expression patients (P＜0.05), suggesting that low XAF1 expression may be associated with the postoperative recurrence of HCC patients. Conclusion The expression level of XAF1 in HCC tumor tissue is lower than that in corresponding normal liver tissues. It may be a potential risk factor for the recurrence of patients with HCC after hepatectomy.

[Key words] XAF1; Liver neoplasm; Recurrence

在全世界腫瘤發生率排名中，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）排名第五位，占死亡率的第四位，已成為常見的肝臟惡性腫瘤[1，2]。然而中國慢性乙肝攜帶人群數超過人口10％，中國是全球HCC最高發的地區之一。目前，接受醫治后的患者復發例數較多，也已成為影響患者生存的不利因素[3]。因此，學術界一直致力于尋求對肝癌術后復發具有預測價值的生物學標記物。本文以新近發現的X染色體相關凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）的相關因子1（XIAP-associated factor 1，XAF1）作為研究對象，該因子具有抑制腫瘤作用，探討其在原發性HCC中控制和抑制復發的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

研究對象根據下列選取標準，獲得2004年1月～2007年1月行手術治療的肝癌患者石蠟標本38份：（1）術后均經病理學證實確診為肝細胞癌患者；（2）術前均未接受任何抗腫瘤治療；（3）所有病例無合并HCV感染者，均為單一HBV感染患者；（4）均在隨訪或者術前獲取病理學資料，包括腫瘤體積、腫瘤病灶數目等；（5）均為中國漢族人種。38例患者其中男34例，女4例，平均年齡（47.0±2.3）歲，以上患者均獲得隨訪。隨訪截止日期2008年12月31日。

1.2 免疫組織化學

采用北京中杉金橋生物技術公司生產二氨基聯苯胺、M二步法免疫組化試劑盒。采用二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、38例HCC的石蠟標本4 μm厚度切片；濃度為3％的雙氧水孵育10 min后，抗原熱修復在pH6.0的枸櫞酸緩沖液中完成，加熱在95℃左右微波爐進行15 min；自然冷卻后，滴加兔抗人XAF1多克隆抗體（美國USBiological公司）孵育4 ℃過夜；第2天復溫后在二抗孵育25 min；根據流程DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片。以磷酸緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS）對照，胞漿中見棕黃染色。結果依據陽性細胞所占百分比及著色深淺進行判定，陽性細胞數計分：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞76%為4分。細胞著色強度計分：無顯色：0分，淡黃色：1分，棕黃色：2分，棕褐色：3分。2項評分總和為總積分，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（＋），≥4分為陽性（++）[4]。

1.3 統計學方法

應用SPSS15.0統計學軟件，XAF1表達與臨床病理資料之間的相關性采用χ2（卡方）檢驗，無復發生存率分析采用Kaplan-Meier法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 XAF1在肝組織中的表達情況

免疫組化結果顯示，XAF1蛋白在38例（100%，38/38）人肝癌癌旁正常組織中均呈現高表達；而在肝癌組織中的表達陽性率為36.84%（14/38），兩者差異具有統計學意義（P＜0.05）。本研究將24例XAF1蛋白低表達肝癌患者歸類為XAF1低表達組（封三圖1），另14例XAF1蛋白在肝癌組織及對應癌旁正常肝組織中的表達基本相同，將其歸類于XAF1正常組（封三圖1）。實驗結果中，未檢測到XAF1表達明顯高于健康肝組織的狀況。

2.2 XAF1蛋白表達水平與臨床病理因素的相關性

采用χ2（卡方）檢驗分析了XAF1表達與患者臨床病理參數之間的相關性，比較得到XAF1的低表達與PVTT（P=0.012）、AFP高水平（P=0.016），腫瘤大小（P=0.037）均有關，而與性別、年齡、腫瘤數量、組織學分級無關。見表1。

2.3 影響肝癌術后復發的危險因素分析

24例XAF1蛋白低表達肝癌患者中，18例（75.0%，18/24）術后1年復發，6例（25.0%，6/24）未復發；14例XAF1蛋白正常表達肝癌患者中，6例（42.9%，6/14）術后1年復發，8例（57.1%，8/14）未復發。采用Kaplan-Meier法分析無復發生存率，結果如表1所示，XAF1蛋白的低表達與復發顯著相關（P=0.048）。

3 討論

最新發現的腫瘤抑制因子X是存在染色體17p13區域的染色體相關凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）的相關因子1（XIAP-associated factor 1，XAF1）。研究表明，XAF1蛋白的表達缺失或降低往往影響腫瘤的進展和預后。Byun等[5]發現XAF1蛋白的表達缺失不僅與胃癌的進展有關，而且和一些癌癥患者的無瘤生存率及總體生存率也有關[6]。日本學者對24例HCC切除患者的肝癌組織標本進行免疫組織化學檢測后發現，XAF1的表達與腫瘤細胞的凋亡顯著相關[7]，但鮮有相關報道。

此外，Chung等[8]報道在結腸癌中XAF1蛋白的表達下調具有腫瘤特異性，且與腫瘤進展及病理分級有關。Sakemi等[7]發現肝癌組織中XAF1的表達水平與腫瘤分化相關，低分化肝癌組織中XAF1的表達水平遠低于中高分化肝癌組織，提示XAF1蛋白的表達水平可能與肝癌患者的臨床病理參數有關。本實驗結果顯示，肝癌組織中XAF1蛋白表達水平與患者PVTT、術前AFP水平、腫瘤大小等臨床病理指標之間存在相關性。單因素分析結果表明，患者術前AFP水平、腫瘤大小、腫瘤數量均與腫瘤術后復發相關，該結果與最新研究認為臨床組織學因素與腫瘤術后復發存在相關性一致[9]。本研究結果表明，XAF1在預測肝癌術后復發方面具有潛在的應用價值，但要應用于臨床還需大樣本、前瞻性、多中心的研究進一步加以證實。

[參考文獻]

[1]Bosch FX，Ribes J，Borras J. Epidemiology of primary liver cancer[J]. Semin Liver Dis，1999，19（3）：271-285.

[2]Kew MC. Epidemiology of hepatocellular carcinoma[J]. Toxicology，2002， 181-182：35-38.

[3]Yoo HY，Patt CH，Geschwind JF，et al. The outcome of liver transplantation in patients with hepatocellular carcinoma in the United States between 1988 and 2001：5-year survival has improved significantly with time[J]. J Clin Oncol，2003，21（23）：4329-4335.

[4]Kempkensteffen C，Fritzsche FR，Johannsen M，et al. Down-regulation of the pro-apoptotic XIAP associated factor-1（XAF1） during progression of clear-cell renal cancer[J]. BMC Cancer，2009，9：276.

[5]Byun DS，Cho K，Ryu BK，et al. Hypermethylation of XIAP-associated factor 1，a putative tumor suppressor gene from the 17p13.2 locus，in human gastric adenocarcinomas[J]. Cancer Res，2003，63（21）：7068-7075.

[6]Kempkensteffen C，Hinz S，Schrader M，et al. Gene expression and promoter methylation of the XIAP-associated Factor 1 in renal cell carcinomas：correlations with pathology and outcome[J]. Cancer Lett，2007， 254（2）：227-235.

[7]Sakemi R，Yano H，Ogasawara S，et al. X-linked inhibitor of apoptosis（XIAP）and XIAP-associated factor-1 expressions and their relationship to apoptosis in human hepatocellular carcinoma and non-cancerous liver tissues[J]. Oncol Rep，2007，18（1）：65-70.

[8]Chung SK，Lee MG，Ryu BK，et al. Frequent alteration of XAF1 in human colorectal cancers：implication for tumor cell resistance to apoptotic stresses[J]. Gastroenterology，2007，132（7）：2459-2477.

[9]Zhang Q，Chen X，Zhou J，et al. CD147，MMP-2，MMP-9 and MVD-CD34 are significant predictors of recurrence after liver transplantation in hepatocellular carcinoma patients[J]. Cancer Biol Ther，2006，5（7）：808-814.

（收稿日期：2011-04-29）