2-甲氧基雌二醇對全腦缺血大鼠HIF-1α及RTP801的作用研究

彭靜華 張鴻日 黃麗娜 李云

[摘要] 目的 探討2-甲氧基雌二醇（2ME2）對全腦缺血大鼠HIF-1α及凋亡相關基因RTP801的作用。 方法 將成年雄性SD大鼠104只隨機分為對照組（n=8）、全腦缺血組（n=48）和全腦缺血2-甲氧基雌二醇干預組（n=48），后兩組按再灌注時間不同各分為6個亞組。采用改良的Pulsineli 4-VO方法行全腦缺血大鼠模型制作。Nissl染色進行海馬神經元計數，免疫組化及RT-PCR技術進行HIF-1α及RTP801 mRNA表達檢測。 結果 全腦缺血2ME2干預組與全腦缺血組相應時間點亞組相比，神經細胞計數明顯增加，HIF-1α表達減少，RTP801 mRNA表達減低（P＜0.05）。 結論 在全腦缺血急性期，2ME2抑制HIF-1α及凋亡相關基因RTP801表達，具有一定的神經保護作用。

[關鍵詞] RTP801；全腦缺血；缺氧誘導因子-1；2-甲氧基雌二醇

[中圖分類號] R743.31 [文獻標識碼] B[文章編號] 1673-9701（2012）01-006-03

Effects of 2ME2 on hypoxia-inducible factor 1α and apoptosis-related gene RTP801 in hippocampus following the global cerebral ischemia in rats

PENGJinghua1 ZHANGHongri2 HUANGLina1 LI Yun3

1.Department of Neurology, the First Affiliated Hospital to Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China;2.Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital to Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; 3.Department of Emergency, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China

[Abstract] Objective To investigate the effect of 2ME2 on the hypoxia-inducible factor 1α and apoptosis-related gene RTP801 in hippocampus following the global cerebral ischemia in rats. Methods One hundred and four adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: sham group (n=8), global cerebral ischemia group (n=48) and global cerebral ischemia + 2ME2 treatment group (n=48), and the rats of GI group and GI + 2ME2 group were sacrificed after perfusion. The 4 vessel occlusion (4-VO)global ischemia rat model was produced. Nissl staining was used to perform quantitative analysis of cell numbers. Immunohistochemistry staining and RT-PCR provided the information of the distribution of positive cells to HIF-1α protein and the expression of RTP801 mRNA. Results The number of cells from GI + 2ME2 group was significantly higher than that from GI group (P＜0.05). 2ME2 significantly suppressed the levels of HIF-1α (P＜0.05). The expression of apoptosis-related gene RTP801 decreased significantly(P＜0.05). Conclusion 2ME2 has brain protective effect on global cerebral ischemia in rats. 2ME2 inhibits the elevation of hypoxia-inducible factor 1α, which inhibits the elevation of apoptosis-related gene RTP801.

[Key words] RTP801; Global cerebral ischemia; Hypoxia-inducible factor 1; 2-methoxyestradiol

缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是能在低氧狀態下被激活的核轉錄因子，國內外已有許多的研究表明在輕度腦缺血時缺氧誘導因子-1表達增加具有保護作用，但是，有研究表明，在嚴重缺血缺氧時，大量HIF-1的表達表現為損傷性作用[1，2]。全腦缺血可發生于心跳驟停、休克、顱腦外傷、外科手術中的低壓等情況。目前，在全腦缺血缺氧過程中，關于缺氧誘導因子-1在神經細胞的凋亡中的作用及機制尚不明確，國內外相關報道較少。本實驗應用HIF-1的抑制劑2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）作用于全腦缺血大鼠模型，探討2ME2對全腦缺血大鼠HIF-1α及凋亡相關基因RTP801的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康雄性成年Sprague-Dawley大鼠104只，體重（320±21）g（購于上海實驗動物中心），隨機分為假手術組（Sham）、全腦缺血組（GI）及全腦缺血2-甲氧基雌二醇干預組（GI+2ME2）3組，其中全腦缺血組及全腦缺血2-甲氧基雌二醇干預組按再灌注時間的不同，分為6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d 6個亞組，假手術組和各亞組均為8只大鼠。

1.2 模型制作及組織獲取

全腦缺血大鼠模型制作采用改良的Pulsineli 4血管閉塞法[3]。應用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，手術電凝大鼠椎動脈，24 h后同樣方法麻醉，將大鼠雙側頸總動脈同時夾閉10 min，同時將大鼠腦缺血前后以及取下夾閉頸總動脈的動脈夾后的腦電圖作記錄。在實驗設計的不同時間點將大鼠經心灌注固定，取腦組織，行Nissl染色及免疫組化染色。用于行RT-PCR檢測的大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，分離出雙側海馬，放置于-80℃低溫冰箱中保存。

1.3 2-甲氧基雌二醇干預

全腦缺血2-甲氧基雌二醇干預組中大鼠，2-甲氧基雌二醇腹腔注射應用于松開雙側頸總動脈夾后（用量16 mg/kg），6 h、12 h及24 h亞組大鼠應用2-甲氧基雌二醇1次，48 h組在第2天應用1次同樣劑量，72 h、7 d組在第3天和第7天分別各應用1次同樣劑量。GI組應用等量生理鹽水腹腔注射，假手術組不給予干預措施。2-甲氧基雌二醇購于Sigma公司。

1.4 Nissl染色

將冰凍切片室溫放置30 min，放入4 ℃丙酮固定10 min；置于50～60 ℃溫箱內、1%甲苯胺藍水溶液中40 min；蒸餾水洗滌；95%乙醇分化；脫水及透明后封片。

1.5 HIF-1α蛋白表達的檢測

應用免疫組織化學S-P法檢測HIF-1α蛋白的表達，DAB顯色，具體操作步驟按照試劑說明。HIF-1α多克隆一抗由武漢博士德公司提供。應用PBS代替一抗做陰性對照。

1.6 RTP801 mRNA表達的檢測

采用逆轉錄多聚酶鏈反應（RT-PCR）法檢測。Trizol提取RNA、反轉錄及PCR的實際步驟依照試劑盒說明。RTP801引物及β-actin由Invitrogen公司（美國）提供，cDNA合成試劑盒、Trizol試劑盒和PCR擴增試劑盒均由生工生物工程（上海）有限公司供應。

1.7 統計學處理

在高倍鏡下，于每張切片海馬的CA1區隨機選擇5個視野進行神經元密度（神經元數/高倍鏡視野）及HIF-1α陽性細胞計數，數據以（χ±s）的形式表示，數據采用SPSS 13.0軟件包進行統計分析，全腦缺血組及全腦缺血2-甲氧基雌二醇干預組中各亞組與假手術組間比較采用方差分析，全腦缺血組及全腦缺血2-甲氧基雌二醇干預組相應時間點間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 全腦缺血大鼠模型制作

在夾閉大鼠雙側頸總動脈后2～3 min內，腦電圖顯示為一直線表明模型制作成功。夾閉大鼠雙側頸總動脈10 min，將雙側動脈夾同時取下，可見大鼠腦電波有部分程度的恢復，但腦電圖的頻率以及波幅均低于頸總動脈夾閉之前。

2.2 Nissl染色以及神經元計數

假手術組中大鼠海馬的CA1區為3～5層，神經元形態清晰、數目多，染色比較均勻。GI組大鼠海馬CA1區細胞數減少，并且可見神經細胞腫脹、變形、溶解并形成空泡。GI+2ME2組48 h、72 h、7 d亞組與GI組相應亞組對比海馬CA1區細胞計數增加，差異有統計學意義（t分別為4.59、4.58、8.86，P＜0.05），同時細胞損傷減輕，形態較規則，邊緣較清晰，軸突形態較好。染色神經元細胞數見表1（個/高倍視野，×400）。

2.3 HIF-1α蛋白表達的免疫組化檢測

鏡下以棕黃色細顆粒為HIF-1α蛋白陽性信號。在假手術組中蛋白陽性信號極其少見。而GI組的蛋白陽性信號于缺血后6 h逐漸增加，在缺血后72 h達最高水平，7 d后基本到達正常。GI+2ME2組48 h、72 h、7 d亞組大鼠海馬CA1區HIF-1α較GI組相應亞組蛋白陽性信號低，差異有統計學意義（t分別為5.14、6.07、10.40，P＜0.05）。陽性表達的細胞數見表2（個/高倍視野，×400）。

2.4 RTP801 mRNA表達的RT-PCR檢測

RTP801 mRNA在假手術組大鼠中未見表達，而缺血6 h后可見GI組大鼠RTP801 mRNA表達增加，先隨著時間的延長而升高，24h后隨著時間的延長而降低，7d后下降至正常水平。GI+2ME2組12 h、24 h、48 h、72 h亞組較GI組相應亞組RTP801 mRNA表達減少，差異有統計學意義（t分別為4.59、7.07、4.79、4.71，P＜0.05）。RTP801吸光度比值見表3。

3 討論

2-甲氧基雌二醇是雌激素的正常代謝產物，存在于人體的血液與尿液中，可在轉錄后水平抑制HIF-1α[4]。HIF-1是由α、β兩個亞基形成的異二聚體核轉錄因子，能夠被低氧狀態所激活[5]。HIF-1α屬于氧敏感亞基，HIF-1穩定性主要由α亞基控制，HIF-1β在細胞中穩定表達。HIF-1參與調控下游一系列靶基因表達，目前發現由HIF-1直接啟動的基因有60余個，其中包括一些HIF-1依賴的凋亡相關基因[1，2，5，6]以及對缺氧適應性的基因，在腦缺血過程中HIF-1α相關促凋亡基因主要有p53、bcl-2家族某些成員（如其中bcl-Xs、bax等）、caspase（caspase 3、caspase 8、caspase 9）、RTP801、HGTD-P等。此類基因的表達可促進細胞的凋亡。我們的實驗結果表明，2ME2可抑制HIF-1α的過度表達，從而抑制靶基因的表達，具有神經保護作用[6]。Helton R等[7]研究發現，將HIF-1α基因敲除后，HIF-1α在腦缺血缺氧小鼠中表達缺失，凋亡相關的基因表達減少，表明HIF-1α表達缺失在腦缺血的過程中具有一定神經保護作用，從而推測HIF-1α過度表達在腦缺血缺氧中是有害的。

RTP801是HIF-1α依賴的凋亡相關基因。RTP801是Shoshani T等[8]首次發現的，在腦缺血動物模型及細胞培養中均發現其表達明顯上調，在大腦中動脈閉塞大鼠模型缺血半暗帶以及壞死區應用原位雜交技術均檢測到RTP801，腦缺血缺氧過程中RTP801表達升高見于0.5～2.0 h內，持續至少3 d，RTP801對缺氧反應動態的變化與已知的其他如VEGF等HIF-1靶基因類似，這提示了RTP801可能也是HIF-1依賴基因之一。實驗顯示，正常ES細胞中，在缺氧條件下RTP801 mRNA的表達可被強烈誘導，而在HIF-1α-/- ES細胞內同樣缺氧條件下卻沒有檢測到其表達，因此推測，HIF-1α調控缺氧條件下RTP801表達。RTP801表達作用可表現為促進凋亡或抗凋亡兩方面。應用質粒將RTP801 cDNA轉移至小鼠肺細胞中，這可導致大量細胞的死亡。在MCF7和PC12細胞中導入四環素選擇的啟動子后可促進RTP801的表達，葡萄糖缺乏的培養基中、低氧條件下以及H2O2誘導凋亡中可見細胞被保護，但是，在不再分裂的PC12細胞中，RTP801的表達增加具有細胞毒性，其可增加細胞對缺氧和氧化的敏感性。因此，RTP801過度表達所產生的生物學效應取決于多種因素，包括細胞類型和狀態，不同狀態下在不同類型的細胞中，RTP801具有損傷或保護作用。本實驗顯示，腦缺血缺氧6 h組大鼠可見RTP801表達，表達至高峰見于24 h組大鼠，此后表達逐漸減少，7 d組表達降至正常水平，可見RTP801 mRNA表達于全腦腦缺血缺氧急性期。2-甲氧基雌二醇治療組中可見神經元計數增加，HIF-1α蛋白減少，RTP801表達減少，從而證明了RTP801是HIF-1依賴的，這個結果與Shoshani T等[8]結果也是一致的。因此，我們推測：在全腦缺血急性期，2ME2抑制HIF-1α及凋亡相關基因RTP801的表達，具有一定的神經保護作用。

[參考文獻]

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[7]Helton R，Cui J，Scheel JR，et al. Brain-specific knock-out of hypoxia-inducible factor-1 alpha reduces rather than increases hypoxic-ischemic damage[J]. J Neurosci，2005，25（16）：4099-4107.

[8]Shoshani T，Faerman A，Mett I，et al. Identification of a novel hypoxia-inducible factor 1-responsive gene，RTP801，involved in apoptosis[J]. Mol Cell Biol，2002，22（7）：2283-2293.

（收稿日期：2011-09-19）