人膜蛋白CD81原核表達與純化

摘要：以高效原核表達載體pCold TF為載體骨架，應用PCR、限制性酶切、連接等分子生物學方法，將pCold TF中的六聚組氨酸（HisTag）序列替換為限制性酶切位點SpeⅠ序列ACTAGT，構建不含HisTag序列的新載體pL118.以此載體表達蛋白時，通過PCR引物在目的基因3′端添加HisTag以利于融合蛋白的純化以及融合蛋白中的Trigger Factor（TF）助溶蛋白的去除.應用pL118對人膜蛋白CD81進行原核表達與純化，并使用Factor Xa蛋白酶去除CD81融合蛋白中的TF助溶蛋白，獲得3′端含有HisTag的CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表達純化，為CD81靶向藥物篩選、抗體制備及深入研究CD81的功能奠定了基礎.pL118載體的構建以及CD81蛋白的表達純化為表達困難的基因實現原核表達提供了一種新的思路和方法.

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關鍵詞：載體；人CD81；蛋白表達；純化

中圖分類號：Q816 文獻標識碼：A

pCold TF原核表達載體是一種插入蛋白可溶性標簽的融合型冷休克表達載體，空載體融合表達的順序為六聚組氨酸（HisTag）、Trigger Factor（TF）、蛋白酶切位點和多克隆位點序列.蛋白酶切位點依次為HRV 3C protease，Thrombin和Factor Xa，用于去除融合蛋白的可溶性標簽.TF是一種原核的核糖體結合伴侶蛋白，相對分子質量約4.8×104，它能夠促進新生肽鏈的共翻譯折疊，與目的蛋白融合表達，提高目的蛋白的可溶性.載體上帶有冷休克表達系統，嚴格控制載體在低溫條件下才能表達目的蛋白，進一步促進了目的蛋白的可溶性表達.

人CD81是一種四跨膜的非糖基化膜蛋白，由胞內的N端和C端、4個跨膜結構域、胞外小環和胞外大環4部分組成，相對分子質量約2.6×104，在B細胞、T細胞、肝細胞等多種細胞中均有表達.CD81參與細胞的粘附和信號轉導，具有影響細胞增殖和分化等生物學功能［1］，是細胞表面的免疫調節分子［2］，并參與丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染宿主細胞，作為HCV的一個受體介導病毒顆粒進入宿主細胞［3］，HCV包膜蛋白E2與CD81胞外大環相互結合實現HCV的感染［4-5］.針對CD81的靶向藥物及特異性抗體具有抑制HCV感染的潛在功能［6-7］，人膜蛋白CD81的原核表達與純化，為今后靶向藥物篩選、抗體制備及深入研究CD81與HCV之間的關系奠定了基礎.

湖南大學學報(自然科學版)2012年

第8期朱海珍等：人膜蛋白CD81的原核表達與純化

pET28b是一種常規的原核表達載體，含有T7啟動子、乳糖操縱子和多克隆位點序列等基本功能元件，在蛋白原核表達與純化實驗體系中應用廣泛.在預實驗中，將人cd81基因克隆到pET28b載體中嘗試原核表達，發現沒有可溶性目的蛋白的表達.pCold TF不僅有pET28b中的基本功能元件，還包含了冷休克表達系統和TF助溶蛋白，通過嚴格控制目的蛋白低溫表達，以及TF的可溶性標記功能和分子伴侶作用，可以使一些表達困難的基因獲得更高概率的可溶性表達.本課題改造pCold TF載體，在保留冷休克及融合表達系統的前提下，去除原載體上的HisTag序列，一方面提高了人CD81蛋白融合表達的效率和可溶性，另一方面有利于融合蛋白中的TF助溶蛋白的去除，獲得不含助溶蛋白標簽的全長人CD81蛋白.

1 材料與方法

3 討論

pCold TF載體擁有冷休克表達系統和TF助溶蛋白，一些表達困難的基因在pCold TF中有更高概率的可溶性表達.但是目的基因在pCold TF中表達得到的融合蛋白含有4.8×104的TF助溶蛋白標簽，標簽的分子質量偏大，對目的蛋白結構及功能有較大的影響，而去除TF卻不方便，因為融合蛋白表達的順序為HisTag、TF助溶蛋白、蛋白酶切位點、目的蛋白，利用蛋白酶對融合蛋白進行酶切后，目的蛋白將和HisTag、TF助溶蛋白分開成為兩個蛋白片段，目的蛋白不含HisTag，不利于目的蛋白的再回收.本文對pCold TF載體進行改造，使之不含HisTag序列，將目的基因克隆到該載體時，通過在目的基因3′端引物添加HisTag序列，其融合蛋白表達的順序為TF助溶蛋白、蛋白酶切位點、目的蛋白、HisTag，其中HisTag不僅可用于融合蛋白的純化，也可用于融合蛋白酶切后目的蛋白的純化，因為HisTag仍然保留在目的蛋白上，也可作為標簽用于Western blot中目的蛋白的檢測，以及結合在NiNTA等載體上，用于進一步目的蛋白功能研究和特異性藥物篩選等.

通過對pCold TF載體序列中限制性酶切位點的分析，發現位于HisTag序列前端的NheⅠ和后端的BubⅠ是載體中單一的酶切位點，且載體不含酶切位點SpeⅠ.通過設計特定的PCR引物，并運用PCR、限制性酶切、連接等分子生物學方法，成功去除pCold TF載體中的HisTag序列，并且不影響原載體的蛋白表達能力，將此新質粒命名為pL118.pL118繼承了原載體高效蛋白可溶性表達的優點，并使之有利于去除融合蛋白中的TF助溶蛋白，將HisTag保留在目的蛋白上.在應用pL118表達融合蛋白時要特別注意的是：在目的基因3′端引物引入HisTag序列時，將HigTag序列放置在目的基因的編碼序列和終止密碼子之間，如果HisTag序列放置在終止密碼子之后，融合蛋白的表達將提前終止而不含HisTag.

膜蛋白具有多種多樣的細胞功能，是基礎研究及藥物開發的理想靶標，然而研究膜蛋白有一個難題，它們的過表達對宿主有毒性而限制蛋白產量，或產生包涵體增加純化難度.人CD81是一種四跨膜蛋白，將其克隆到pET28b載體中嘗試原核表達，發現沒有可溶性目的蛋白的表達，關于CD81原核表達的文獻報道也集中于CD81胞外大環可溶片段的表達.CD81參與細胞的粘附和信號轉導，具有影響細胞增殖和分化等生物學功能，是細胞表面的免疫調節分子，并作為受體介導HCV感染宿主細胞.近期有報道稱，CD81不僅是HCV感染中的一個受體，還可影響HCV RNA的復制［8］，或通過激活細胞的Raf/MEK/ERK信號通路而影響HCV在宿主細胞中的生活周期［9］，在慢性丙型肝炎病人的血清中，可溶性的CD81蛋白水平升高，并參與病人肝纖維化的形成［10］，因此對CD81的進一步研究具有重要的理論與實踐意義.

4 結語

本文將CD81克隆到pL118載體中，實現了CD81融合蛋白高效可溶性表達，使用NiNTA親和層析柱對融合蛋白純化，再利用Factor Xa蛋白酶去除TF助溶蛋白，成功獲得含有HisTag的全長CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表達純化證實了pL118載體使表達困難的基因獲得更高概率的可溶性表達，為CD81靶向藥物篩選、抗體制備及深入研究CD81與HCV之間的關系奠定了基礎.pL118載體的構建以及CD81蛋白的表達純化方法具有一定的創新性，為表達困難的基因實現原核表達提供了一種新的思路和方法.

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