人乳頭瘤病毒基因分型在宮頸病變中的應(yīng)用

摘 要 目的：探討人乳頭瘤病毒基因分型在宮頸病變中的應(yīng)用。方法：對(duì)1452例無癥狀健康體檢婦女開展的以宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查和陰道鏡檢查為主要手段的合并肉眼檢查先后涂以3%醋酸或10%碘酸鉀試驗(yàn)為輔的宮頸癌篩查［1］。同時(shí)，進(jìn)行反身點(diǎn)雜交法進(jìn)行人乳頭瘤病毒(HPV)基因分型。結(jié)果：1452例體檢者中檢出人乳頭瘤病毒147例(10.1%)，其中低危險(xiǎn)型別感染5例，高危險(xiǎn)型別感染140例，低、高危險(xiǎn)型別混合感染2例，對(duì)檢查陽性者，均進(jìn)行宮頸組織活檢，術(shù)后隨診。結(jié)論：人乳頭瘤病毒基因分型檢查，提高宮頸癌前病變的早期診斷和治療極為重要，可是宮頸病的診斷提前到臨床前癌。同時(shí)，人乳頭瘤病毒基因分型檢查可作為評(píng)估預(yù)后的參考指標(biāo)。

關(guān)鍵詞 反向點(diǎn)雜交法 人乳頭瘤病毒 宮頸病變

使用反向點(diǎn)雜交法進(jìn)行HPV基因分型，進(jìn)一步提高診斷水平，監(jiān)測(cè)追蹤病毒惡性變化，有效評(píng)估疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)治療，排除非致病毒HPV感染，便于病理醫(yī)生和臨床之間的溝通和交流，更好地為臨床服務(wù)。

資料與方法

2011年7～12月收治無癥狀健康體檢者1452例，年齡21～68歲，平均35歲。

方法：⑴標(biāo)本處理：在無菌條件下，用特制的宮頸刷插入宮頸管內(nèi)約2cm，旋轉(zhuǎn)數(shù)周并停留片刻后取出，采取足量的宮頸細(xì)胞樣本，避免宮頸接觸出血，將宮頸刷脫甩放入裝有保存液的小瓶中漂洗宮頸刷，瓶子寫上標(biāo)簽送檢。轉(zhuǎn)動(dòng)宮頸刷，將宮頸刷上的細(xì)胞洗脫于1ml生理鹽水中，洗脫液轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，10 000rpm離心5分鐘。棄上清，沉淀加50μl DNA提取液充分混勻，100℃保溫10分鐘(誤差不超過1分鐘)。10 000rpm離心5分鐘，上清備用。⑵PCR擴(kuò)增：取PCR反應(yīng)管編號(hào)，分別加入提取上清5μl，6 000rpm瞬時(shí)(3秒)離心后，將各反應(yīng)管放入PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：93℃ 3分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 40秒→55℃ 40秒→72℃ 40秒擴(kuò)增，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸7分鐘，98℃變性8分鐘后，置冰塊上放2分鐘。⑶雜交操作過程：①雜交液Ⅰ與雜交液Ⅱ預(yù)熱至45℃，備用：打開水浴搖床，待溫度穩(wěn)定后用溫度計(jì)校正搖床溫度至45℃。②將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物98℃，8分鐘變性，立即置于冰水混合物中2分鐘以上；③取n個(gè)(n=樣品數(shù))5ml離心管，鑷取HPV分型檢測(cè)雜交膜條膜條邊緣并編號(hào)，對(duì)應(yīng)將膜條放入離心管中，加入約4ml預(yù)熱雜交液Ⅰ，備用；④將PCR產(chǎn)物加入對(duì)應(yīng)的離心管中，然后平放入水浴搖床中，低速轉(zhuǎn)動(dòng)(100～150rpm)，雜交50分鐘；⑤棄雜交液Ⅰ，將膜條取出，放入50ml離心管中，加入20ml預(yù)熱雜交液Ⅱ，每個(gè)離心管可最多同時(shí)放入5張膜條，放入水浴搖床(45℃)，100rpm，水浴10分鐘，棄雜交液Ⅱ。重復(fù)1次，水浴5分鐘；⑥棄雜交液Ⅱ，將50ml離心管倒置于吸水紙上，吸干管底液體，加入20ml結(jié)合液，放置于20℃～30℃生化搖擺儀(或搖擺式脫色搖床)上搖擺(30～50rpm)，避光(黑色塑料薄膜包好離心管)反應(yīng)10分鐘；⑦棄結(jié)合液，將50ml離心管倒置于吸水紙上，吸干管底液體，加入20ml 20～30℃雜交液Ⅰ，生化搖擺儀上搖擺3分鐘，棄雜交液Ⅰ。重復(fù)(步驟⑤)2次；⑧棄雜交液Ⅰ，將50ml離心管倒置于吸水紙上，吸干管底液體。加入20ml溶液Ⅱ，生化搖擺儀上搖擺3分鐘；⑨棄溶液Ⅱ，將50ml離心管倒置于吸水紙上，吸干管底液體。加入顯色液20ml，避光反應(yīng)5～10分鐘；⑩顯色反應(yīng)結(jié)束后，立即棄顯色液，加入20ml溶液Ⅱ，生化搖擺儀上搖擺3分鐘，棄溶液Ⅱ，加入20ml蒸餾水，輕搖2～3分鐘取出。用吸水紙吸去膜條表面水分，盡快在掃描儀上掃描膜條(若不能立即進(jìn)行掃描，請(qǐng)凍存于-20℃)，進(jìn)行結(jié)果判定。

結(jié) 果

在1452例反向點(diǎn)雜交法進(jìn)行HPV基因分型檢查，陽性147例，陽性率10.1%。其中，液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果，描述性診斷(TBS)［2］：正常或炎癥，未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞(Asc-us)不能除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變的不典型鱗狀上皮細(xì)胞(Asc-H)29例；宮頸上皮內(nèi)瘤變CIN Ⅰ級(jí)78例；CIN Ⅱ級(jí)13例；CIN Ⅲ級(jí)(含宮頸原位癌)20例；子宮頸癌7例。人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)陽性者，均在陰道鏡下進(jìn)行宮頸組織活檢。

討 論

目前，已經(jīng)確定的感染女性生殖道HPV大約35種型別，約20種與腫瘤相關(guān)，依據(jù)不同型別HPV與腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性高低分為低危險(xiǎn)型別和高危險(xiǎn)型別HPV，低危險(xiǎn)型別HPV包括HPV6、11、42、43等型別，常引起外生殖道器濕疣等良性病變，包括宮頸上皮內(nèi)低度病變(CIN Ⅰ級(jí))；高危險(xiǎn)型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型別，與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變(CIN Ⅱ/CIN Ⅲ級(jí))的發(fā)生相關(guān)，尤其是HPV16、18型［3，4］。

宮頸病變，如慢性宮頸炎、宮頸糜爛是婦科常見病、多發(fā)病，長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作是誘發(fā)宮頸癌發(fā)病的重要因素。宮頸癌為女性惡性腫瘤中最常見者，占女性生殖器惡性腫瘤的首位，早期可無任何癥狀，隨著病情的發(fā)展可出現(xiàn)白帶增多及接觸性出血，性交、大便及陰道鏡檢查，往往可出現(xiàn)無痛性陰道出血。但近年來，由于HPV感染的蔓延，宮頸癌發(fā)病出現(xiàn)明顯年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅年輕女性的健康與生命，已受到婦產(chǎn)科醫(yī)生的高度重視。而我國目前開展宮頸癌篩查方法比較混亂，尤其是在貧困邊遠(yuǎn)經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的地區(qū)，傳統(tǒng)巴氏涂片作為宮頸癌篩查方法的主要手段，而傳統(tǒng)巴氏涂片不能取到宮頸管內(nèi)細(xì)胞，較難取到鱗柱交界細(xì)胞，再加之一些人為因素的影響，比如：涂片質(zhì)量差，細(xì)胞重疊，用力不均，細(xì)胞形態(tài)人為破壞等，使宮頸病變漏診率高。

本組1452例開展以宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查和陰道鏡檢查為主要手段的合并肉眼檢查先后涂以3%醋酸或10%碘酸鉀試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，同時(shí)開展人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)，能明確提高異常的細(xì)胞檢出率，準(zhǔn)確檢查出宮頸癌病變，有效防治宮頸癌，是宮頸病變篩查的好方案［5］。本組資料中，有3例HPV檢測(cè)高危險(xiǎn)型陽性，宮頸組織活檢CIN Ⅱ級(jí)，治療后，6個(gè)月后復(fù)查，發(fā)現(xiàn)這3例HPV感染轉(zhuǎn)陰，再次在陰道鏡下宮頸組織活檢，不見宮頸CIN Ⅱ級(jí)，證實(shí)治愈。縣級(jí)以上的醫(yī)院，如果均能規(guī)范化、科學(xué)化性的開展宮頸癌篩查方法，既有效地提高陽性率和確診率，又為鑒別診斷提供了更多手段，從而更進(jìn)一步提高廣大婦女的幸福指數(shù)。

參考文獻(xiàn)

1 宋志寥，王譪明，何曉珍.液基細(xì)學(xué)配合陰道檢查對(duì)宮頸病變的診斷價(jià)值.中國內(nèi)鏡雜志，2004，10(4):106-109.

2 郎景和.子宮頸上皮病變的診斷與治療.中華婦產(chǎn)科雜志，2001，36(5):261.

3 Bosch FX，Lorinci A，Munoz，et al.The causal relation between huma papillomauir usand cervical cancer［J］.J clin pathol，2002，55:244-265.

4 鄭英，王春萍，劉玉玲，趙虎.宮頸/陰道液基細(xì)胞學(xué).鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社，2009.

5 喬友林，章文華，李凌，等.子宮頸癌篩查方法的橫斷面比較研究.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，1:50-53.