軟肝升白顆粒對小鼠肝纖維化的影響

劉金霞 郭爭榮 孫殿興 吳松柏

(承德醫(yī)學院,河北 承德 050098)

細胞外基質(zhì)沉積和降解失去平衡是肝細胞損傷后導致肝纖維化的主要原因。目前，臨床上還缺乏確切有效的逆轉(zhuǎn)肝纖維化藥物，以冬蟲夏草、丹參和復方 861 合劑、鱉甲軟肝片等具有活血化瘀、軟堅散節(jié)功效的單方或復方中藥制劑具有比較好的抗肝纖維化療效。中藥組方能夠多環(huán)節(jié)、多層次及多靶點的綜合作用，具有廣闊的抗纖維化開發(fā)和應用前景。本研究通過建立硫代乙酰胺誘導的小鼠肝硬化模型，采取不同時間和不同劑量分別觀察軟肝升白顆粒對層粘連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)含量的影響，以及肝組織中肝細胞生長因子(HGF)及其受體c-Met mRNA的表達水平，旨在探討軟肝升白顆粒抗纖維化的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 軟肝升白顆粒由白求恩國際和平醫(yī)院制劑科配制，復方鱉甲軟肝片由解放軍302醫(yī)院研制，內(nèi)蒙古集寧制藥廠饋贈，生產(chǎn)批號20060609；硫代乙酰胺(TAA)購買于Sigma公司； HA、LN檢測試劑盒購自上海海軍醫(yī)學研究所；清潔級Wistar雄性小鼠100只，體重(18±20)g，由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2造模和分組給藥 TAA用精確度為1/萬的電子天平稱取并用飲用水稀釋，采用TAA誘導法制備小鼠肝纖維化模型。20只為正常組(E組)，用飲用水喂養(yǎng)，其余均用0.03%TAA誘導飼喂〔1〕，每1～2 d更換1次飲用水，誘導時間20 w。造模成功后隨機分為四組，每組20只， A組小鼠給予軟肝升白顆粒8 g·kg-1·d-1(相當于成人劑量7倍)灌胃，B組給予4 g·kg-1·d-1(相當于成人劑量3.5倍)灌胃，C組小鼠給予鱉甲軟肝片0.8 g·kg-1·d-1(相當于成人劑量的7倍)灌胃，D組(模型對照組)和E組分別給予等體積的生理鹽水灌胃，造模結(jié)束后，停用TAA 1 w后，給予上述藥物治療，1次/d〔2〕。

1.3標本留取和指標檢測 分別在治療后第4、8周處死小鼠，腹主動脈取血，分離血清，由我院檢驗科全自動生化分析儀檢測肝功能，應用放射免疫法檢測小鼠血清HA、LN等肝纖維化指標，盡可能無菌條件下取部分肝組織，0.5×0.5×0.5 cm3，迅速液氮冷凍保存。TRIZOL試劑提取肝組織總RNA，合成cDNA第一條鏈，進行PCR擴增，嚴格按RT-PCR試劑盒說明書操作〔3〕。HGF正向引物5′TCAAATGCCAGCCTTGGAATTCC-3′，反向引物5′TCAAGAGTGTAGCACCATGGC-3′，片段385 bp，退火52℃，循環(huán)數(shù)32；C-met正向引物5′AGCTGTACCTTGACCTTAAGC3′，反向引物5′TTCAGGGTCTTCCCAATACC-3′,片段479 bp，退火54℃，循環(huán)數(shù)30；GAPDH正向引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，片段651 bp,退火54℃,循環(huán)數(shù)33。擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進行照相，并進行半定量分析，以目的基因條帶光密度值與內(nèi)參照GAPDH條帶光密度值比，表示目的基因相對表達量。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SAS8.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1軟肝開自顆粒治療小鼠肝纖維化不同時間肝功能水平 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)和總膽紅素(TBil)見表1。

2.2血清HA、LN的變化 HA、LN與肝組織學變化呈正相關(guān)。與E組相比，D組HA、LN均升高(P<0.05)，與D組相比，治療4 w，A、B、C組HA、LN均有所下降，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。治療8 w，A、B、C組HA、LN均有明顯下降(P<0.05)，而A組HA、LN水平下降較B和C組明顯(P<0.05)。見表2。

表1 軟肝升白顆粒治療小鼠肝纖維化不同時間肝功能水平

表2 軟肝升白顆粒治療小鼠肝纖維化不同時間血清

2.4HGF/c-Met系統(tǒng)在各組肝組織中的表達水平 圖1可見，治療4 w時，HGF/c-Met的表達水平在A組明顯高于其他各治療組和E組(P<0.05)，但B組與C組比較差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，D組與E組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。治療8 w時，隨著肝損傷的好轉(zhuǎn)，HGF/c-Met的表達水平有所下降，但在軟肝升白顆粒A組HGF/c-Met的表達水平高于B、D、E其他各組(P<0.05)。

圖1 HGF/c-Met系統(tǒng)在各組肝組織中的表達

3 討 論

肝纖維化屬于中醫(yī)學“瘤”、“痹”、“痞”、“積”等范疇。由于痰瘀互結(jié)，全身氣、血、津液運行不暢，陰陽失調(diào)，最終形成肝纖維化。軟肝升白顆粒由黃芪、丹參、當歸、桃仁、白術(shù)、黨參、梔子、茵陳等16味中藥組成，具有活血軟堅、化痰除濕功效。尤其是丹參和黃芪，屬于活血化瘀和補中益氣類中藥，在臨床以及實驗研究中都被證實有較明確的抗肝纖維化作用，有研究〔4〕認為與其下調(diào)炎性細胞因子、阻斷肝臟庫普弗細胞和肝星狀細胞(HSC)活化、減少膠原組織的合成及促進自由基清除和抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。本研究通過應用軟肝升白顆粒治療小鼠肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)小鼠肝功能、肝纖維化指標明顯好轉(zhuǎn)，檢測HGF/c-MetmRNA水平，進一步證實通過HGF/c-MetmRNA高表達，HGF能夠刺激肝細胞再生，抑制受損肝細胞凋亡的活性物質(zhì)，具有抗肝損傷和抗肝纖維化作用〔5〕。其受體是c-Met原癌基因編碼的一種跨膜酪氨酸激酶，HGF與其結(jié)合，引起酪氨酸激酶活化，激活細胞內(nèi)多個信號級聯(lián)反應，包括磷脂酰肌醇-3(PI-3K)、Grb/sos/Ras復合物、Gab-1、Shp-2、磷脂酶C、Ras-GTP酶活性蛋白和c-Scr等，從而使HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導通路處于激活狀態(tài)，并進一步調(diào)控DNA的合成、細胞周期運轉(zhuǎn)過程中起重要作用的相關(guān)基因的表達，最終使細胞進入增殖期而發(fā)揮作用〔6〕。已知在四氯化碳(CCl4)所致小鼠肝纖維化模型中HGF組能夠促進莖質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13表達的同時，抑制MMP抑制劑(TIMP)-1的表達，MMP-13可與TIMP-1以1∶1非共價結(jié)合使其降解膠原活性受抑制〔6〕。因此，軟肝升白顆粒能夠通過提高HGF及其受體c-Met mRNA的表達，經(jīng)過上述多種信號級聯(lián)反應，改善肝功能的同時，降解細胞外基質(zhì)，促進肝細胞再生，逆轉(zhuǎn)肝纖維化〔7〕。

4 參考文獻

1張 杰,陳積圣,王 坤,等.硫代乙酰胺誘導肝硬化模型方法的改進〔J〕.中華實驗外科雜志,1999;16(6): 567.

2章元沛.藥理學實驗〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:238.

3Okuyama H,Nakamura H,Shimahara Y,etal. Overexpression of thioredoxin prevents thioacetamide-induced hepatic fibrosis in mice〔J〕.J Hepatol,2005;42:117-23.

4Liu Y.Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis：therapeuitc potential and mechanisms of action 〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2010;287(1) :F7-16.

5Matsumoto K,Nakamura T.Hepatocyte growth factor：renotroptic role and potential therapeuics for renal diseases〔J〕.Kidney Int,2009;59(6) :2023-38.

6Watanalbe T,Niioka M,Hozawa S,etal. Gene expression of interstitial collagenase in both progressive and recovery phase of rat liver fibrosis induced by carbon tetrachloride〔J〕.J Hepatol,2000;33(2):224-35.

7Kim WH,Matsmoto K,Bessho K,etal.Growth inhibition and apoptosis in liver myofibroblasts promoted by hepatocyte growth factor leads to resolution from liver cirrhosis〔J〕. Am J Pathol,2005;166(14) :1017-28.