miRNA和腫瘤產(chǎn)生的相關(guān)性研究

摘 要 目的：研究miRNA和腫瘤產(chǎn)生的相關(guān)性，探討其能否成為腫瘤產(chǎn)生的指標(biāo)和miRNA在腫瘤中的作用機制及臨床意義，為發(fā)現(xiàn)腫瘤的產(chǎn)生原因、預(yù)后評估和miRNAs相關(guān)治療新靶點提供理論依據(jù)。方法：回顧性分析收治的45例腫瘤患者的臨床資料，取AB兩組，一組為腫瘤病患者，一組為相應(yīng)的非病患裸鼠。取患者身上相應(yīng)的癌細胞，再取裸鼠身上的相應(yīng)的正常細胞。對45例癌標(biāo)本進行免疫組織化學(xué)染色分析。運用實時定量PCR，比較癌細胞系與正常組織間的相應(yīng)miRNA區(qū)別。對45例癌患者和45例正常對照者運用聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)方法對miRNA的多態(tài)性進行分型，分析這個位點的等位基因頻率。結(jié)果：95%miRNA在各種腫瘤組織中的表達水平有不同程度的上調(diào)或下調(diào)，變化均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：這一現(xiàn)象初步解釋了腫瘤發(fā)生與miRNA表達之間存在相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 miRNA 腫瘤 相關(guān)性

MicroRNA(miRNA)作為一類非編碼蛋白質(zhì)，分布廣泛，具有調(diào)控基因表達的作用［1］。生物信息學(xué)研究顯示，單個miRNA對數(shù)百個靶基因可以進行調(diào)節(jié)，這表示所有的信號途徑可能會被miRNA影響。本文就miRNA和腫瘤產(chǎn)生的相關(guān)性做一初步探討。

資料與方法

回顧性分析今年上半年收治的45例腫瘤患者的臨床資料，其中肺癌患者20例，白血病患者15例，淋巴瘤患者10例。

方法：取A、B兩組，一組為腫瘤患病者，一組為相應(yīng)的非病患裸鼠。取患病者身上相應(yīng)的癌細胞，再取裸鼠身上的相應(yīng)的正常細胞。例如肺癌患者，取肺部癌細胞，再裸鼠的肺部細胞。對45例癌標(biāo)本進行免疫組織化學(xué)染色分析。運用實時定量PCR，比較癌細胞系與正常組織間的相應(yīng)miRNA區(qū)別。對45例癌患者和45例正常對照者運用聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)方法對miRNA的多態(tài)性進行分型，分析這個位點的等位基因頻率。在miRNA為雜合子的3種癌細胞株中，運用雙熒光標(biāo)記實時定量-PCR方法(Real-time PCR)對于2個等位基因分別相應(yīng)的miRNA進行定量比較。運用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件的Logistic回歸、Kaplan-Meier曲線、Cox多因素回歸等模塊分析上述結(jié)果與臨床資料的聯(lián)系。

結(jié) 果

在癌組織中相應(yīng)的miRNA的免疫組織化學(xué)染色分析表明，高Gleason評分的癌組織較低Gleason評分的癌組織染色強度降低。各組間染色分析結(jié)果表明PSA≥100。A組較其他PSA組別染色陽性率減少(P=0.010)；A組較其他分期組別染色陽性率增多(P=0.021)；Gleason評分B組較A組染色陽性率降低(P=0.031)；運用多變量Cox成比例危險因子模型分析表明，陰性miRNA的染色結(jié)果是在伴生化復(fù)發(fā)或肺癌特異性生存的獨立預(yù)測因素(OR 2.143，95%CI 1.035～4.132；OR 2.365，95%CI 1.194～5.485)。實時定量PCR結(jié)果表明，miRNA表達量在肺癌細胞系中較正常肺部組織顯著降低，miRNA與原癌基因存在顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.678，P＜0.001；r=-0.670，P＜0.001)。研究結(jié)果證實，miRNA與肺癌進展為負(fù)相關(guān)，可能發(fā)揮著抑制癌進展的作用。45例癌患者和45例對照組對miRNA運用PCR-RFLP進行分型，含有基因Dicer與肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移(D期)的相關(guān)性具有統(tǒng)計意義(P=0.010)，Dicer基因型發(fā)生肺癌轉(zhuǎn)移的危險性增高(aOR 1.906，95%CI 1.166～3.115)。Dicer基因型在發(fā)生病理高分級的危險性增高(aOR 1.646，95%CI 1.076～2.517)。生存分析表明：Dicer基因型在初診為D期患者的肺癌特異性生存時間顯著縮短(P=0.007)；在進行癌細胞清除術(shù)后的患者中，Dicer基因在肺癌復(fù)發(fā)時間顯著縮短(P=0.002)。多變量Cox成比例危險因子模型表明，Dicer基因型是預(yù)后的獨立預(yù)測因子(HR 4.658，P=0.019)。研究結(jié)果證實，Dicer基因在miRNA結(jié)合位點的肺癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)具有重要作用。結(jié)合通過miRNA與靶基因預(yù)測網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，運用雙熒光標(biāo)記的實時定量PCR，結(jié)果表明癌細胞較正常細胞產(chǎn)生的mRNA水平明顯升高或降低。發(fā)現(xiàn)：①在肺癌中發(fā)現(xiàn)Dicer的表達下調(diào)，抽查70個非小細胞肺癌樣品其中DROSHA及DICER的miRNA表達情況。檢測結(jié)果顯示術(shù)后存活期縮短與DICER的表達量下降關(guān)聯(lián)，說明肺組織的轉(zhuǎn)化也許是Dicer阻止的。研究證明缺乏Dicer的鼠胚胎干細胞雖然會產(chǎn)生異染色質(zhì)不足的情況，但其結(jié)果不會導(dǎo)致染色體的結(jié)構(gòu)或者數(shù)目不正常。即使注射缺乏Dicer的胚胎干細胞至裸鼠中并不會有腫瘤發(fā)生的可能。所以，Dicer也許是非直接作用于腫瘤的發(fā)生，具有腫瘤抑制因子效應(yīng)的miRNA的減少可能是通過其缺失而導(dǎo)致的。上述研究證實了此基因在哺乳動物發(fā)育和四肢形成、T細胞發(fā)育、干細胞正常分化的重要地位，提示在此過程中起著重要作用的是成熟的miRNA。故Dicer和肺癌的聯(lián)系證明了這個基因是通過miRNA來影響肺組織分化的。②在慢性B淋巴細胞白血病中miR-15a和miR-16a-1表達下調(diào)，并且編碼這兩種miRNA基因的染色體區(qū)域13q14有50%以上是發(fā)生缺失的。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a和miR-16a-1是BCL2基因的反義作用因子。這兩種miRNA可通過抑制BCL2蛋白的表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。當(dāng)這兩種miRNA表達下調(diào)或缺失時，對轉(zhuǎn)錄后水平BCL2的負(fù)調(diào)節(jié)作用降低，致使BCL2的表達升高，促使發(fā)生白血病。③miR-15a與miR-16-1有調(diào)控BCL2作用，它是抗凋亡基因，在許多腫瘤中過度表達，miR-15a和miR-16-1的下調(diào)或缺失，使得BCL2表達上升，促使產(chǎn)生淋巴瘤。

討 論

miRNAs是在動植物中新發(fā)現(xiàn)的一大類基因表達調(diào)控因子，miRNAs主要借助誘導(dǎo)RNA介導(dǎo)(RNAi)的干擾途徑對其進行干擾［2］。在植物中，此種miRNA介導(dǎo)的基因沉默機制相對常見，于哺乳動物中也偶可看到。實際上，哺乳動物中的絕大部分miRNAs不會降解靶mRNA，有其他機制調(diào)控基因表達［3］。于轉(zhuǎn)錄后的水平上，所有miRNAs主要借助mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTRs)與非完全堿基配對，在等同或類似于RNA干擾途徑中所使用的RISC復(fù)合物中，抑制基因翻譯。同樣經(jīng)抑制翻譯的miRNAs只是減少其靶基因的蛋白質(zhì)表達水平，并不影響mRNA水平［4］。實際上miRNAs與其靶基因僅部分互補也會起降解mRNA的作用，有待研究的是，翻譯抑制的發(fā)生時機是在mRNA降解的前還是后。由RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)轉(zhuǎn)錄而成的miRNAs，稱之為pri-miRNA的前體分子是初始產(chǎn)物。細胞核內(nèi)的pri-miRNAs被雙鏈RNA 結(jié)合蛋白Pasha及RNase Ⅲ Drosha改造為一個約由70個核苷酸構(gòu)成的具有不完全的莖環(huán)分子結(jié)構(gòu)的pre-miRNA。GTP與RAN所依賴的exportin 5 將此前體分子輸入細胞質(zhì)。然后另一個RNase Ⅲ Dicer把莖環(huán)結(jié)構(gòu)剪切成約22個核苷酸長度的miRNA：miRNA*雙鏈，雙鏈和miRISC復(fù)合體相整合，成熟的miRNA即保留于具有功能的復(fù)合物中反向調(diào)控靶基因的表達。人類中的大多數(shù)其miRNAs在非編碼蛋白或編碼蛋白的mRNA 轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子區(qū)域，其余或在mRNA非編碼的外顯子區(qū)域，或在基因組的轉(zhuǎn)錄本之間，或在mRNA3’非翻譯區(qū)域［5］。也有一些miRNAs聚成一個miRNA基因簇，如19號染色體上的54個miRNAs 聚成了一個基因簇［6］?？梢越柚蛄型葱缘囊?guī)律對miRNAs進行分組和歸類。miRNAs在癌癥中起重要作用，miRNAs充當(dāng)基因調(diào)節(jié)器作用，能夠調(diào)控細胞生長、分化和凋亡。在許多人類腫瘤病例中，都發(fā)現(xiàn)miRNA表達異常，要么是在成熟的miRNAs，要么是在前體miRNAs，或者二者皆有。因此，miRNAs表達水平的改變在腫瘤形成中也起重要作用［7］。與正常組織相比，雖然在腫瘤組織中大多數(shù)miRNAs表達都下降，但是也有高表達的miRNAs被發(fā)現(xiàn)。鑒于此，miRNA基因被認(rèn)為既充當(dāng)腫瘤抑制基因也充當(dāng)癌基因角色。

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