突發(fā)疫情中炭疽芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)

摘 要 目的：結(jié)合本地區(qū)近期發(fā)生的炭疽疫情，總結(jié)關(guān)于炭疽桿菌的樣本采集、分離培養(yǎng)、鑒定及菌種保存方面的經(jīng)驗(yàn)，以提供借鑒。方法：采集土壤、牛羊糞便、疑似病例皮膚滲出物、血液等樣本92份，分別進(jìn)行涂片鏡檢、分離培養(yǎng)及鑒定。結(jié)果：其中有8份皮膚滲出物樣本炭疽芽孢桿菌鑒定為陽(yáng)性。結(jié)論：應(yīng)盡量在消毒、抗生素應(yīng)用之前采集標(biāo)本，直接壓片法涂片鏡檢率高，同時(shí)進(jìn)行溶血性試驗(yàn)、青霉素敏感試驗(yàn)和噬菌體試驗(yàn)鑒定。

關(guān)鍵詞 炭疽 采樣 分離 鑒定

炭疽是由炭疽芽孢桿菌引起的一種人畜共患的傳染病，人們從認(rèn)識(shí)這種疾病并與之斗爭(zhēng)已有100余年的歷史［1］。我國(guó)西部農(nóng)牧業(yè)地區(qū)云南、貴州、新疆等地為人間炭疽高發(fā)區(qū)，每年炭菌病例占全國(guó)炭菌病例總數(shù)的90%以上［2］。疫情來(lái)臨時(shí)，實(shí)驗(yàn)室人員能否正確采樣，快速和準(zhǔn)確的從樣品中分離鑒定出炭疽芽孢桿菌是防治疫情、診療患者工作的關(guān)鍵。

2011年7～9月內(nèi)蒙古自治區(qū)興安盟地區(qū)突發(fā)炭疽疫情，全部病例均有病死牛羊接觸史，均出現(xiàn)了皮膚丘疹水泡、傷口破潰、有黑色焦痂形成、患肢水腫、患側(cè)淋巴結(jié)腫大等癥狀，臨床表現(xiàn)似皮膚炭疽。在此次疫情中，興安盟疾控中心和各旗縣疾控中心、各醫(yī)院通力合作，采集包括土壤、牛羊糞便、疑似病例皮膚滲出物、血液等樣本共92份，其中有8份皮膚滲出物樣本分離出炭疽芽孢桿菌，依據(jù)WS283-2008炭疽診斷標(biāo)準(zhǔn)，此8位患者確診為皮膚炭疽。筆者總結(jié)了在炭疽桿菌檢測(cè)中采樣、分離培養(yǎng)、鑒定及菌種保存等方面的一些經(jīng)驗(yàn)，以提供借鑒。

樣本采集

樣本采集份數(shù)：對(duì)每個(gè)采樣對(duì)象，宜采集4份標(biāo)本，分別用于涂片鏡檢、直接培養(yǎng)、增菌培養(yǎng)和留樣復(fù)核。

采樣時(shí)間、樣本類型：幾年來(lái)炭疽芽孢桿菌的檢出率一直較低，尤其是開(kāi)展疫源地檢測(cè)以來(lái)，所采集的外環(huán)境標(biāo)本中從未檢出炭疽芽孢桿菌，這與采集標(biāo)本的及時(shí)性、季節(jié)性標(biāo)本質(zhì)量有著重要關(guān)系［3］。采集患者樣本要盡量在應(yīng)用抗生素治療之前，采集環(huán)境標(biāo)本亦最好在消毒處理之前。當(dāng)采集患者皮膚滲出物標(biāo)本時(shí)未用藥或用藥1天內(nèi)分離并鑒定為炭疽菌的檢出率100%，當(dāng)用藥超過(guò)1天時(shí)炭疽菌檢出率驟降2.94%，患者血液標(biāo)本檢出率0%，提示皮膚炭疽患者血液標(biāo)本不易檢出炭疽桿菌，皮膚滲出物中炭疽菌分離率高。

采樣方法：鏡檢發(fā)現(xiàn)大量?jī)啥似烬R且呈串聯(lián)狀排列的革蘭氏陽(yáng)性大桿菌是炭疽感染臨床診斷的依據(jù)［4］，而涂片方法決定了鏡檢的檢出率。因直接壓片法涂片能夠獲得較大的標(biāo)本量，鏡檢陽(yáng)性率高。但要注意玻片要高壓滅菌，輕壓患者創(chuàng)口以免擴(kuò)大感染。

分離培養(yǎng)

可用無(wú)菌生理鹽水將采樣棉簽浸濕，三區(qū)劃線法直接涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，這樣能夠獲得盡可能多的菌落，避免了漏檢。

增菌培養(yǎng)是很必要的，已確證的菌株中，有1株就是從增菌液中分離出來(lái)的。

炭疽桿菌和其他類芽孢桿菌顯微鏡檢、菌落形態(tài)的鑒別：炭疽芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等均屬于蠟樣芽孢桿菌屬，具有高度的同源性，形態(tài)上極其相似［5］。將已確證為炭疽芽孢桿菌的菌株和類炭疽菌加以比較。認(rèn)識(shí)炭疽菌和類炭疽菌形態(tài)上的區(qū)別，有助于我們正確選取菌落進(jìn)行分離純化。炭疽芽孢桿菌較一些雜菌生長(zhǎng)緩慢，宜在培養(yǎng)8～12小時(shí)時(shí)觀察、分離培養(yǎng)，否則就可能會(huì)被生長(zhǎng)迅速的雜菌覆蓋而漏檢。

鑒 定

根據(jù)WS3-2008炭疽診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診病例，必須分離培養(yǎng)到目標(biāo)菌。

鑒定炭疽芽孢桿菌生物化學(xué)很少做［6］，PCR檢測(cè)目前不作為確證試驗(yàn)。炭疽、蘇云金、蠟樣和巨大芽孢桿菌等屬于蠟樣芽孢桿菌屬，具有高度的同源性；有多位點(diǎn)酶電泳研究認(rèn)為其屬于同一各種，因此在其染色體上設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(cè)常存在交叉反應(yīng)。炭疽芽孢桿菌具有兩個(gè)致病相關(guān)的質(zhì)粒Pxo1和Pxo2，質(zhì)粒的穩(wěn)定性較染色體差，亦缺失。國(guó)內(nèi)陳蘇紅等人采用SYBR Green1摻入法和復(fù)核探針?lè)ǚ謩e針對(duì)位于質(zhì)粒Pxo1和Pxo2上的pag基因、cap基因、ropB基因進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià)其靈敏度、特異性，能夠滿足初篩的要求［7］。此次疫情中9份標(biāo)本PCR擴(kuò)增檢測(cè)為陽(yáng)性其中8份樣本確證為炭疽芽孢桿菌，1份為蠟樣芽孢桿菌。

確診炭疽芽孢桿菌必須的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果為顯微鏡檢查、溶血性試驗(yàn)、青霉素敏感試驗(yàn)和噬菌體試驗(yàn)均為陽(yáng)性。

在做噬菌體試驗(yàn)時(shí)，要避免噬菌體的污染，否則可能導(dǎo)致假陰性，一瓶新開(kāi)啟的噬菌體，應(yīng)用若干無(wú)菌小瓶分裝；懷疑污染時(shí)，可做噬菌體培養(yǎng)以檢驗(yàn)是否可用。

菌株保存

從培養(yǎng)1天的固體培養(yǎng)基上用一次性接種針挑取單個(gè)菌落，穿刺半固體培養(yǎng)管，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，第2天取出，在半固體表面滴加少量滅菌甘油。每株菌至少制備兩支，記錄制備支數(shù)。將菌種管置于菌種保藏盒中，4℃保存。

保存菌株時(shí)可同時(shí)再做噬菌體和青霉素試驗(yàn)，以保證選取菌落的正確。

參考文獻(xiàn)

1 梁旭東.炭疽防治手冊(cè)［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995.

2 莊漢瀾.炭疽［M］.唐家琪.自然疫源性疾病.北京:科學(xué)出版社，2005:913-939.

3 馬韶輝，汪春翔，葛華.兩起炭疽突發(fā)疫情中炭疽芽孢桿菌的分離鑒定［J］.中國(guó)人畜共患病學(xué)報(bào)，2010，27(7):703-706.

4 衛(wèi)生部.《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定管理的法定傳染病診斷標(biāo)準(zhǔn)，2004，21-22.

5 俞東征.人獸共患傳染病學(xué).北京:科學(xué)出版社，2009:340-341.

6 徐建國(guó)，張建中，萬(wàn)康林，等.現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌學(xué).北京:科學(xué)出版社，2011:536-539.

7 張玲，翟俊輝，周冬生，等.熒光定量PCR快速檢測(cè)炭疽芽孢桿菌高的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)人畜共患病雜志，2005，21(11):976-980.