Wistar大鼠長(zhǎng)期高鹽攝入對(duì)心臟功能的影響及機(jī)制探討*

羅碧輝，曾昭華，蘇誠(chéng)堅(jiān)，潘秀娣，潘潔貞

有研究認(rèn)為高鹽攝入與血壓呈正相關(guān)，是高血壓發(fā)展的主要罪魁禍?zhǔn)祝?］。高血壓性心臟病病理生理學(xué)的現(xiàn)代觀點(diǎn)認(rèn)為，鹽是高血壓最重要的環(huán)境因素，可能會(huì)加劇心肌重構(gòu)過(guò)程中的致重構(gòu)分子與抗重構(gòu)分子之間的失衡狀態(tài)［2］。眾所周知，心肌重構(gòu)是心功能不全的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本研究3周齡Wistar大鼠給予18周4%的高鹽飲食，旨在研究導(dǎo)致的心肌重構(gòu)及心臟舒縮功能的影響。

1 材料與方法

動(dòng)物及分組:2002-10自廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心一次性購(gòu)Wistar大鼠27只(均為國(guó)家一級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):粵檢證字2002A044號(hào);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施合格證號(hào):粵檢證字2002C069號(hào))，均為雄性，均在哺乳期(3周齡)后。隨機(jī)分成高鹽飼養(yǎng)組14只和正常飼養(yǎng)組13只，飼以含鹽量不同飼料(購(gòu)自廣東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。高鹽飼養(yǎng)組大鼠以高鹽(含4%NaCl)顆粒飼料飼養(yǎng);正常飼養(yǎng)組以正常鹽(含0.5%NaCl)顆粒飼料飼養(yǎng)，持續(xù)喂養(yǎng)18周(即21周齡)。

血壓測(cè)定:兩組大鼠于實(shí)驗(yàn)前(3周齡)時(shí)測(cè)第一次鼠尾血壓;實(shí)驗(yàn)后(以不同含鹽量飼料飼養(yǎng)后)滿2、4、8、12、16 周(即滿5、7、11、15、19 周齡時(shí))各測(cè)血壓一次(鼠尾套袖血壓計(jì)為HX-Ⅱ型小動(dòng)物血壓計(jì))。測(cè)量時(shí)，要待大鼠保持安靜后，電子表數(shù)值恒定后取值。

生化指標(biāo)檢測(cè):21周齡后檢測(cè)各組大鼠血漿醛固酮濃度、血漿血管緊張素Ⅱ濃度，按說(shuō)明書(shū)要求取血后進(jìn)行測(cè)定(均購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所)。

心臟功能測(cè)定:首先將血壓換能器與插管連接好，開(kāi)機(jī)，調(diào)出Pclab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(北京微信斯達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)，第一次使用時(shí)先進(jìn)行采樣條件設(shè)置，并為血壓傳感器定標(biāo)，調(diào)試好后保存配置，以后每次實(shí)驗(yàn)都采用該配置。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，插管內(nèi)充滿肝素溶液，并排除全部氣泡。

大鼠予戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉后，行右頸總動(dòng)脈插管，先描記頸動(dòng)脈壓，穩(wěn)定一段時(shí)間后(約二分鐘)，沿血管路徑經(jīng)主動(dòng)脈瓣進(jìn)入左心室腔，描記心室搏動(dòng)波形。測(cè)量平均動(dòng)脈壓時(shí)，選取描記開(kāi)始30秒后，五個(gè)呼吸周期的平均動(dòng)脈壓平均值;測(cè)量左心室功能各項(xiàng)指標(biāo)，選取進(jìn)入心室腔30秒后的五個(gè)呼吸周期取各項(xiàng)平均值。記錄的指標(biāo)包括:左心室舒張末壓、左心室壓力上升和下降最大速率、心率，均由計(jì)算機(jī)直接顯示。

左心室重量體重比和心臟形態(tài)學(xué)檢查:做完各種檢查后，處死大鼠后取出大鼠心臟，放入高鉀停搏液(鉀離子濃度為16mmol/L)，待心臟完全停止跳動(dòng)后取出，沿房室交界處剪去血管根部，左右心房及心耳;沿室間隔分離出左心室(含室間隔)，用濾紙吸干，稱(chēng)左心室重量，并計(jì)算左心室重量與體重之比，作為左心室肥厚的指標(biāo)，即左室重量指數(shù)。然后將左心室放入10%甲醛溶液固定，24 h之后，進(jìn)行膠原纖維染色(Masson三色法)。Masson三色法染色結(jié)果判斷:膠原纖維呈藍(lán)色，胞質(zhì)，肌纖維和紅細(xì)胞紅色，胞核呈藍(lán)褐色。病理切片用萊卡圖象采集系統(tǒng)及萊卡Qwin圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析，在膠原染色下，放大400倍，因?yàn)闃?biāo)本間染色程度可能不均一，色彩方面取標(biāo)本自身對(duì)照(即以該標(biāo)本切片內(nèi)心肌周?chē)苣z原顏色為內(nèi)對(duì)照)，觀察各組膠原量及分布變化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行分析:計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示;用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)差異的顯著性(分析前要進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn));用直線相關(guān)分析研究變量間的線性關(guān)系的程度。取雙側(cè)95%可信區(qū)間。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高鹽飲食對(duì)Wistar大鼠血壓的影響

在實(shí)驗(yàn)前(3周齡)，兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠尾收縮壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)滿8周(11周齡)起，高鹽飼養(yǎng)組大鼠收縮壓明顯比正常飼養(yǎng)組高(P＜0.05)，并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)滿16周，且隨飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，收縮壓差值進(jìn)一步加大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(表1)

表1 兩組實(shí)驗(yàn)前后收縮壓情況(，mmHg)

表1 兩組實(shí)驗(yàn)前后收縮壓情況(，mmHg)

注:與正常飼養(yǎng)組比*P＜0.05。1mmHg=0.133 kPa

時(shí)間收縮壓正常飼養(yǎng)組(n=13)高鹽飼養(yǎng)組(n=14)實(shí)驗(yàn)前(3周齡) 58.7±3.1 58.7±2.7實(shí)驗(yàn)滿2周(5周齡) 88.7±3.3 90.8±2.9實(shí)驗(yàn)滿4周(7周齡) 111.0±5.5 113.5±4.1實(shí)驗(yàn)滿8周(11周齡) 109.6±5.3 126.9±2.1*實(shí)驗(yàn)滿12周(15周齡) 112.6±5.6 134.3±4.2*實(shí)驗(yàn)滿16周(19周齡) 113.3±4.1 148.3±9.7*

2.2 兩組實(shí)驗(yàn)滿18周時(shí)體重、左心室重量指數(shù)、生化

指標(biāo)和心臟功能指標(biāo)情況

實(shí)驗(yàn)滿18周時(shí)(21周齡)，高鹽飼養(yǎng)組的左心室重量指數(shù)、平均心室舒張末期壓、平均心率均比正常飼養(yǎng)組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05);高鹽飼養(yǎng)組的血漿醛固酮濃度、血漿血管緊張素Ⅱ濃度、平均收縮間期均比正常飼養(yǎng)組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05);兩組的體重、平均舒張間期、左心室壓力最大上升速率及下降最大速率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。(表2)

表2 兩組實(shí)驗(yàn)滿18周時(shí)體重、左心室重量指數(shù)、生化指標(biāo)和心臟功能指標(biāo)情況()

表2 兩組實(shí)驗(yàn)滿18周時(shí)體重、左心室重量指數(shù)、生化指標(biāo)和心臟功能指標(biāo)情況()

注:與正常飼養(yǎng)組比*P＜0.05 ＊＊P＜0.01。

正常飼養(yǎng)組(n=13)高鹽飼養(yǎng)組(n=14)體重(g) 419.7±20.8 409.6±32.9左心室重量指數(shù)(mg/g) 2.1±0.1 2.6±0.2＊＊生化指標(biāo)血漿醛固酮濃度(pg/ml) 0.5±0.2 0.2±0.1＊＊血漿血管緊張素Ⅱ濃度(pg/ml) 1468.7±329.3 755.2±330.1＊＊心臟功能指標(biāo)平均收縮間期(s) 72.7±8.2 65.2±6.8*平均舒張間期(s) 90.3±9.1 89.4±10.2平均心室舒張末期壓(mmHg) －1.5±4.0 2.7±4.0*平均心率(次/分) 345.1±24.1 398.6±17.8＊＊左心室壓力最大上升速率 5810.5±320.4 6443.1±358.2左心室壓力下降最大速率 －4995.0±343.5 －4985.4±366.1

2.3 心肌病理改變

心肌Masson染色后的形態(tài)學(xué)檢查提示高鹽飼養(yǎng)組大鼠心肌間隙較正常飼養(yǎng)組減少，心肌間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)散在藍(lán)色條索狀膠原纖維。(圖1)

圖1 心肌病理改變 Masson染色。圖1a 正常飼養(yǎng)組:圖中央藍(lán)色部分為血管膠原的染色，心肌間隙明顯，心肌間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量藍(lán)色點(diǎn)狀分布的膠原纖維。圖1b 高鹽飼養(yǎng)組:圖中央可見(jiàn)小血管，血管膠原染成藍(lán)色，心肌間隙仍較多見(jiàn)，較正常飼養(yǎng)組減少，心肌間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)散在藍(lán)色條索狀膠原纖維

2.4 高鹽飼養(yǎng)組各變量相關(guān)性檢驗(yàn)

應(yīng)用雙變量相關(guān)分析，結(jié)果顯示左心室重量指數(shù)與心率呈正相關(guān)(r=0.729，P＜0.05);血管緊張素濃度與平均舒張間期呈負(fù)相關(guān)(r=－0.736，P＜0.05)。

3 討論

有研究認(rèn)為高鹽攝入與血壓呈正相關(guān)，是高血壓發(fā)展的主要罪魁禍?zhǔn)祝?］。高血壓性心臟病病理生理學(xué)的現(xiàn)代觀點(diǎn)認(rèn)為，鹽是高血壓最重要的環(huán)境因素，可能會(huì)加劇心肌重構(gòu)過(guò)程中的致重構(gòu)分子與抗重構(gòu)分子之間的失衡狀態(tài)［2］。眾所周知，心肌重構(gòu)是心功能不全的結(jié)果基礎(chǔ)。既往文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)道中所采取的含鹽量由2%至8%不等，采取的研究周期波動(dòng)于2周到4周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，均發(fā)現(xiàn)心肌出現(xiàn)重構(gòu)現(xiàn)象。但未同時(shí)研究心臟功能的改變特點(diǎn)。本研究3周齡大鼠給予18周4%的高鹽飲食，旨在研究長(zhǎng)期高鹽飲食對(duì)心功能的影響及其機(jī)制的初步探討。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常飼養(yǎng)組大鼠相比，18周4%的高鹽飲食導(dǎo)致大鼠心功能出現(xiàn)變化:高鹽飼養(yǎng)組大鼠心臟平均收縮間期縮短，心率明顯增快，平均心室舒張末期壓升高;兩組左心室壓力最大上升速率、下降最大速率及平均舒張間期無(wú)顯著性差異。心功能出現(xiàn)改變與心臟重構(gòu)相伴隨。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，高鹽飼養(yǎng)組大鼠左心室重量指數(shù)顯著高于正常鹽飼養(yǎng)組;此外，本實(shí)驗(yàn)心肌病理圖像顯示高鹽飼養(yǎng)組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)重構(gòu)現(xiàn)象。與文獻(xiàn)報(bào)道一致［3］。

本實(shí)驗(yàn)提示長(zhǎng)期高鹽飲食可導(dǎo)致心臟重構(gòu)。心肌纖維化是高血壓性心肌重構(gòu)的重要特征之一，是多種改變的綜合結(jié)果。文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為，左心室功能障礙/衰竭起初為舒張功能受損，表現(xiàn)為心臟舒張的速率和吸力以及被動(dòng)充盈的僵硬度出現(xiàn)改變，進(jìn)一步發(fā)展為收縮功能障礙［2］。本研究結(jié)果認(rèn)為長(zhǎng)期高鹽進(jìn)食后，大鼠心室舒張末期壓升高可能與心臟平均收縮間期縮短后，收縮末期殘留在心腔內(nèi)的血容量增多有關(guān)，本研究未提示心室的順應(yīng)性下降。這也許是更為早期的心臟功能改變特點(diǎn)。Gianfranco等［4］通過(guò)心率、動(dòng)脈血壓變異性以及壓力感受器的敏感性來(lái)研究鹽對(duì)自主神經(jīng)系統(tǒng)活性的影響，發(fā)現(xiàn)高鹽飲食可以提高心臟交感神經(jīng)活性，增快心率，這與壓力感受器的敏感性增加。

到目前為止報(bào)道的致心臟重構(gòu)因子有十余種，環(huán)境因素(即:高鈉飲食)可能會(huì)加劇前面提到的致重構(gòu)分子與抗重構(gòu)分子之間的失衡狀態(tài)。本研究與本課題組既往報(bào)道一致，長(zhǎng)期予以高鹽飼料飼養(yǎng)，大鼠血壓升高［3］。除此之外，在致心臟重構(gòu)方面高鹽飲食可能是一個(gè)非血壓依賴性的獨(dú)立影響因素，即使在不改變血壓的情況下仍可以產(chǎn)生對(duì)心肌的不良影響［5］。

腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)也是重要的參與心臟重構(gòu)的體液因素，高鹽攝入增加心臟內(nèi)醛固酮合成，促進(jìn)心肌肥厚［5］。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期高鹽飲食出現(xiàn)左心室重構(gòu)的同時(shí)，循環(huán)血中的血管緊張素Ⅱ濃度和醛固酮濃度顯著下降，該現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道一致，也與機(jī)體在早期高鹽攝入時(shí)的代償機(jī)制相符合，即在高鹽攝入時(shí)，機(jī)體代償性地抑制腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)的活性，以便促鈉排出體外;而低鹽則在顯著降低血壓的同時(shí)，激活循環(huán)血中腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)［6，7］。據(jù)最新文獻(xiàn)報(bào)道，高鹽飲食時(shí)，循環(huán)血中醛固酮盡管降低，但心臟局部獨(dú)立的血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)活性增加，心臟組織中的血漿血管緊張素Ⅱ、ATIR mRNA的表達(dá)增高，以及醛固酮濃度升高，雖然這些物質(zhì)未進(jìn)入循環(huán)池，但同樣促使心臟發(fā)生重構(gòu)，對(duì)心肌肥厚的形成及維持有著重要的意義［6，8-9］。有研究予以12 周齡 Wistar大鼠低鹽(0.3%)與高鹽(8%)喂養(yǎng)，低鹽組血漿的腎素活性、AngⅡ及醛固酮濃度升高，但心臟并無(wú)重構(gòu)現(xiàn)象［10］。給予醛固酮阻滯劑或者血管緊張素Ⅱ阻滯劑可以抑制高鹽飲食時(shí)心臟局部的RAAS激活［11］。

總之，本研究結(jié)果提示:高鹽攝入體內(nèi)后，抑制循環(huán)中腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)的活性，通過(guò)對(duì)血壓和體內(nèi)的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)產(chǎn)生影響，誘導(dǎo)心肌重構(gòu)，從而對(duì)心臟功能產(chǎn)生影響，心率增快，收縮間期縮短，心室舒張末期壓升高，心臟重構(gòu)與心率呈正相關(guān)，本研究未提示心室存在順應(yīng)性下降。

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