五種抗生素聯合應用對大腸桿菌抗菌效果實驗

杜冬冬，王 濤，常維山

(山東農業大學動物科技學院，山東泰安 271018)

藥物濫用導致大腸桿菌等細菌的耐藥性是影響畜牧業健康發展的主要原因，如何減少細菌耐藥性，已經成為人們越來越關心的話題。著眼于目前養殖行業的實際情況，新獸藥的研發和合理用藥是解決目前問題的關鍵，但是獸藥研發周期長，合理用藥是目前最適合的方法。兩種或兩種以上抗生素藥物配伍時，可發生兩種截然不同的效果。作用相加或協同，療效增強對治療大有裨益，臨床宜多用;作用拮抗，療效降低或毒性增強，對治療頗為有害，臨床禁用［1］。試驗選取的亞胺培南、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉均屬于β－內酰胺類，其作用機理為抑制細菌細胞壁的合成，是繁殖期殺菌劑［2］;阿米卡星，又名丁胺卡那霉素，是半合成的氨基糖苷類抗生素，其作用機理是抑制細菌蛋白質的合成［2］;痢菌凈，又名乙酰甲喹，其作用機制是抑制細菌的DNA合成［2］。亞胺培南抗菌譜最廣，抗菌作用最強，是對β－內酰胺酶高度穩定的一種β－內酰胺類抗生素［3］，本試驗旨在研究亞胺培南與頭孢曲松鈉、亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯用后對大腸桿菌的抗菌活性及聯合效果，從而為臨床用藥提供指導［4－5］。痢菌凈為臨床常用藥，但其治療劑量接近中毒劑量，臨床應用易中毒。研究丁胺卡那與痢菌凈聯合應用對大腸桿菌的抑菌效果，從而確定兩種藥物聯用是否可以降低痢菌凈的用量。通過聯合用藥以減少細菌耐藥性和藥物用量，具有實際應用價值。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 抗菌藥物 亞胺培南(含量 50%，批號10007)，韓國中外制藥株式會社;頭孢曲松鈉(含量98%，批號100723)，上海新亞藥業有限公司;痢菌凈(含量98.5%，批號060509)，成都華康動物藥業有限公司;頭孢噻肟鈉(含量 97.5%，批號100201)，上海新先鋒藥業有限公司;丁胺卡那(含量96%，批號100716)，上海新亞藥業有限公司。

1.1.2 試驗菌株 大腸桿菌(ATCC25922)，南京便診生物科技有限公司。

1.1.3 培養基 Muller－Hinton(MH)肉湯和Muller－Hinton(MH)瓊脂培養基，美國Difco公司產品。

1.2 方法

1.2.1 稀釋藥物 無菌精確稱取亞胺培南、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉、丁胺卡那、痢菌凈，用無菌蒸餾水溶解并稀釋成2048 μg/mL的溶液，于－20℃保存［6］。

1.2.2 菌懸液的制備 從過夜培養的瓊脂培養基平板上挑取3個菌落，接種于MH肉湯中增菌6 h。以平板計數法進行細菌計數后，用MH肉湯稀釋1.5 ×105CFU/mL［7］。

1.2.3 最小抑菌濃度的測定(MIC)參照微量肉湯稀釋法測定各抗生素單用的最小抑菌濃度(MIC)。將亞胺培南、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉、丁胺卡那、痢菌凈等5種抗菌藥物以滅菌MH肉湯倍比稀釋成 23個濃度，分別為 2048、1024……0.0005 μg/mL，分別取 100 μL 依次加入 96 孔板，再將 1.5×105CFU/mL菌液 100 μL加入孔中，37℃過夜培養，觀察結果，以無菌生長的最低濃度為該藥單用最小抑菌濃度 MIC［8－10］。

1.2.4 亞胺培南與頭孢曲松鈉藥物聯合應用對大腸桿菌ATCC25922的FIC指數測定 將亞胺培南和頭孢曲松鈉分別用滅菌MH肉湯倍比稀釋，按棋盤法設計兩兩組合加入一次性96孔板至第11列、第7行(第12列和第8行為空白對照)。根據最小抑菌濃度的測定，使最高濃度為單藥MIC的2倍。抗菌藥物按濃度梯度各取50 μL，再加入1.5×105CFU/mL菌液100 μL，37℃過夜培養，觀察結果，選擇兩藥聯合應用FIC指數最小時作為兩種藥物的最佳組合，并且以該FIC指數判定兩種藥物聯合應用時的效果。亞胺培南與頭孢噻肟鈉、丁胺卡那與痢菌凈FIC指數測定試驗方法同上。

1.2.5 判斷標準 FIC指數 =(MIC甲藥聯用/MIC甲藥單用)+(MIC乙藥聯用/MIC乙藥單用)。FIC指數≤0.5，為協同作用;FIC指數在0.5～1范圍，為相加作用;FIC指數在1～2范圍，為無關作用;FIC指數＞2，為拮抗作用。

2 結果及分析

2.1 亞胺培南與頭孢曲松鈉MIC試驗結果 亞胺培南、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉、丁胺卡那、痢菌凈等5種抗菌藥物對大腸桿菌ATCC25922體外最小抑菌濃度如表1所示，可以看到亞胺培南對大腸桿菌ATCC25922最小抑菌濃度最小，這說明了亞胺培南具有很強的抗菌能力。本次試驗著重研究了亞胺培南與頭孢曲松鈉、亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯合抗菌效果。

2.2 亞胺培南與頭孢曲松鈉聯合應用對大腸桿菌ATCC25922試驗結果 如表2所示，亞胺培南與頭孢曲松鈉聯合應用FIC指數小于0.5，兩藥聯用呈現協同效果。亞胺培南與頭孢曲松鈉聯合應用使兩藥分別增效8倍與16倍。

2.3 亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯合應用對大腸桿菌ATCC25922試驗結果 亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯合應用FIC值數為0.5，說明兩藥呈現協同作用(表3所示)。頭孢噻肟鈉為繁殖期抑菌劑，與亞胺培南聯用其效果增強4倍，大大減少了藥物用量，提高了藥物效果。

表3 亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯合應用FIC值

2.4 丁胺卡那與痢菌凈聯合應用對大腸桿菌ATCC25922試驗結果 痢菌凈是價格便宜、抗菌效果好的藥物，然而其毒性較強，臨床應用治療量與藥物中毒量非常接近。痢菌凈應用中毒是在養殖中經常出現的問題，與丁胺卡那聯合應用可以減少用藥量，提高藥物效果。如表4所示，丁胺卡那與痢菌凈聯合應用FIC值小于0.5，呈現協同作用，可以使痢菌凈在原有治療效果上大大減少用藥量。

表4 丁胺卡那與痢菌凈聯合應用FIC值

3 討論

近年來大腸桿菌耐藥性日趨嚴重，藥物預防和治療用量逐年增加［11］。為減少細菌耐藥性和降低藥物用量，聯合用藥是目前有效的解決方法。應用棋盤微量稀釋法選取亞胺培南與頭孢曲松鈉、亞胺培南與頭孢噻肟鈉、丁胺卡那與痢菌凈聯合應用，研究其對大腸桿菌的抗菌效果。試驗結果顯示亞胺培南與頭孢曲松鈉、亞胺培南與頭孢噻肟鈉、丁胺卡那與痢菌凈聯合應用均呈現協同作用。亞胺培南單用時其MIC為0.125 μg/mL，與頭孢曲松鈉聯合應用時MIC為0.0156 μg/mL，其 MIC值降低至原用藥量的1/8;亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯合應用時亞胺培南MIC值為0.0313 μg/mL，其MIC值降低至原用藥量的1/4，同時亞胺培南與頭孢曲松鈉聯合應用使頭孢曲松鈉增效16倍，而亞胺培南與頭孢噻肟鈉聯合應用使頭孢噻肟鈉增效4倍。這說明相同類型的藥物與亞胺培南聯合應用增效倍數不同，是由于這兩種藥物與細菌的相互作用機制不同所導致。

痢菌凈單用時MIC值為16 μg/mL，與丁胺卡那聯合應用時MIC值為1 μg/mL，其MIC值降低至原用藥量的1/16。痢菌凈在臨床用藥時可以通過與丁胺卡那聯合應用降低其藥物用量，從而使其用量可以遠遠低于其中毒劑量。

總之，這幾種藥物聯合應用不但可以減少用藥量，并且可以降低細菌耐藥性的產生，從而降低用藥成本、減少藥物殘留。

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