HIF－1α及CAⅨ在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

夏 丹

（山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 病理教研室，山東 臨沂276000）

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與缺氧的微環(huán)境密切相關(guān)，缺氧或酸性內(nèi)環(huán)境容易使細(xì)胞發(fā)生自發(fā)突變，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。HIF－1α是缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可增加血管生成而啟動(dòng)腫瘤發(fā)生，介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上調(diào)缺氧相關(guān)基因，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。CAⅨ是近來發(fā)現(xiàn)的檢測(cè)細(xì)胞缺氧的重要指標(biāo)，CAⅨ可以控制酸的上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在缺氧微環(huán)境中生存，使其成為腫瘤治療的潛在靶標(biāo)蛋白［1］。我們用免疫組化法檢測(cè)HIF－1α、CAⅨ在乳腺癌中的表達(dá)，探討其在乳腺癌中表達(dá)的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 取自山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院1998年－2011年乳腺手術(shù)切除的腫瘤組織及其鄰近的正常組織。術(shù)后組織用福爾馬林固定，石蠟包埋。病人有一例為男性，其余均為女性。年齡29－72歲，中位年齡49歲。

1.2 試劑 HIF－1α、CAⅨ一抗，鼠兔通用二步法二抗PV－6000，DAB顯色劑均購于北京中杉金橋公司。

1.3 檢測(cè)方法 組織常規(guī)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片分別用于HE及免疫組化。免疫組化染色步驟：①二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，采用枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）進(jìn)行微波熱修復(fù)20min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次5 min，0.3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，PBS沖洗3次，每次5min，分別滴加 HIF－1Α、CAⅨ一抗，4℃過夜。②復(fù)溫1h，PBS沖洗3次，每次5min，滴加二抗，2h行DAB顯色，顯微鏡觀察5－10min。③蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗2h，梯度酒精干燥，二甲苯透明，中性樹脂封固。設(shè)立陰性、陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 CAⅨ主要為細(xì)胞膜著色，部分CAⅨ細(xì)胞漿著色。HIF－1α主要為細(xì)胞漿著色，部分細(xì)胞同時(shí)存在核染色。腫瘤組織染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)。隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占百分比，分為5級(jí)：0分，染色細(xì)胞＜5%；1分，染色細(xì)胞5%－25%；2分，染色細(xì)胞25%－50%；3分，染色細(xì)胞50%－75%；4分，染色細(xì)胞＞75%。②根據(jù)染色強(qiáng)度分為4級(jí)：0分，不著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，深棕色。每份切片記分＝染色細(xì)胞數(shù)分?jǐn)?shù)＋染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)。所得分?jǐn)?shù)≤1分為陰性結(jié)果，2－3分為“＋ ”，4－5分為“＋＋ ”，6－7分為“＋＋＋”。“＋”計(jì)為低表達(dá)，“＋＋”、“＋＋＋”計(jì)為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05作為差異性有顯著性的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 HIF－1α在乳腺癌中的表達(dá)

88例乳腺癌組織中，有68例檢測(cè)到HIF－1α陽性表達(dá)，陽性率為77%，其中31例呈低表達(dá)，低表達(dá)率為35%，37例呈高表達(dá)，高表達(dá)率為42%（見表1）。HIF－1α大部分表達(dá)在胞漿，部分同時(shí)在胞核中表達(dá)。（如圖1）

2.2 CAⅨ在乳腺癌中的表達(dá)

88例乳腺癌組織中，有51例檢測(cè)到CAⅨ陽性表達(dá)，陽性率為58%，其中32例呈低表達(dá)，低表達(dá)率為36%，19例呈高表達(dá)，高表達(dá)率為22%（見表1）。CAⅨ大部分為胞膜著色，也有胞漿著色的。腫瘤細(xì)胞著色，間質(zhì)細(xì)胞不著色。（如圖2）

圖2 CAⅨ在乳腺癌中的陽性表達(dá) （SP，×200）

表1 HIF－1α、CAⅨ蛋白在乳腺腫瘤組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

（HIF－1α、CAⅨ蛋白在癌旁正常組織及乳腺癌中的表達(dá)均具有顯著差異，P＜0.01）

2.3 HIF－1α、CAⅨ與其它病理特征的關(guān)系

HIF－1α、CAⅨ表達(dá)與腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，組織學(xué)分級(jí)越高，表達(dá)越強(qiáng)，與年齡無關(guān)，二者表達(dá)有明顯相關(guān)性。

3 討論

碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ，CAⅨ）是碳酸酐酶家族（Carbonic anhydrase，CAs）的異構(gòu)體之一，最早是在人宮頸癌Hela細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的，主要分布于細(xì)胞膜。成熟的CAⅨ由具有N端獨(dú)特的蛋白多糖領(lǐng)域、細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)C末端4個(gè)不同區(qū)域組成，是一種與腫瘤相關(guān)的跨膜糖蛋白［2］。近來有研究［3］顯示，活體腫瘤細(xì)胞中的碳酸酐酶可以使瘤細(xì)胞外pH值下降，從而使胞內(nèi)pH值保持穩(wěn)定，因此細(xì)胞能耐受缺氧。此外酸性細(xì)胞外微環(huán)境可以促進(jìn)整合素激活，影響細(xì)胞的黏附和遷移［4］。最近研究表明，低pH值可促進(jìn)誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞表型，從而更好地保持腫瘤的細(xì)胞異質(zhì)性［5］。CAⅨ在調(diào)節(jié)腫瘤pH值方面的重要性提示CAⅨ可能成為有用的腫瘤標(biāo)記物［6］。Brickton［7］研究表明，CAⅨ在口腔鱗狀細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后生存降低密切相關(guān)。Choschzick［8］研究結(jié)果顯示CAⅨ的過度表達(dá)是子宮內(nèi)膜樣卵巢癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后不良指標(biāo)。在我們研究中，CAⅨ在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)率分別為58%、13%，CAⅨ在癌組織中表達(dá)率明顯升高，并且腫瘤分化程度越差、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤組織體積越大，CAⅨ陽性率越高。這一結(jié)果提示CAⅨ表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞更具有生長、浸潤轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢(shì)。

表2 HIF－1α、CAⅨ與其它病理特征的關(guān)系

缺氧誘導(dǎo)因子－lα（hypoxia inducible factor lα，HIF－1α）在人體內(nèi)廣泛存在，是氧穩(wěn)態(tài)和缺氧反應(yīng)調(diào)節(jié)的一種轉(zhuǎn)錄因子。最近有報(bào)道，缺氧激活NF－κB／HIF－1α／VEGF通路，通過增加血管生成而啟動(dòng)腫瘤發(fā)生［9］。Yoo等［10］研究顯示，HIF－1α可介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Ma等［11］推測(cè)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)紊亂可能在缺氧誘導(dǎo)的血管生成擬態(tài)中發(fā)揮作用。Mathieu等［12］研究表明，缺氧通過HIF誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物在多種腫瘤中表達(dá)。Qiang等［13］發(fā)現(xiàn)，HIF－1α通過 Notch信號(hào)通路維持缺氧介導(dǎo)的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤干細(xì)胞特性。上海藥物所丁健課題組研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子c－Jun結(jié)合于HIF－1α的ODD結(jié)構(gòu)域，減少HIF－1α蛋白的泛素化修飾與降解，穩(wěn)定HIF－1α蛋白，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄作用，促進(jìn)其介導(dǎo)的腫瘤血管新生過程，為HIF－1α靶向治療提供了新的思路。在我們研究中，HIF－1α在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)率分別為77%、17%，HIF－1α在癌組織中表達(dá)率明顯升高，并且與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤體積密切相關(guān)。

我們研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中CAⅨ表達(dá)與H IF－1α表達(dá)具有明顯相關(guān)性，提示CAⅨ、HIF－1α可能共同促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移。現(xiàn)在研究認(rèn)為CAⅨ的啟動(dòng)子含有HIF－1α結(jié)合域－缺氧反應(yīng)元件，在正常情況下羥基化形式的HIF－1α能與VHL蛋白結(jié)合，從而被E3泛素連接酶識(shí)別并迅速降解。在缺氧情況下，HIF－1α呈非羥基化形式，不能被E3泛素連接酶識(shí)別并降解，造成HIF－1α積聚，引發(fā)CAⅨ高表達(dá)［14］。Mconald等［15］用 CAⅨ單克隆抗體和特異性CAⅨ小分子抑制劑干擾CAⅨ的活性，破壞癌細(xì)胞PH調(diào)節(jié)，最近已被證明損害原發(fā)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。Petrul等［16］用針對(duì)CAⅨ的抗體藥物共軛BAY 79－4620能有效對(duì)抗CAⅨ陽性的裸鼠移植腫瘤，腫瘤體積完整或部分縮小，甚至用單劑量就可以達(dá)到療效。許多這些藥物在臨床前或臨床發(fā)展，構(gòu)成了一種新型的癌癥治療有針對(duì)性的戰(zhàn)略。

綜上所述，HIF－1α、CAⅨ在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯升高，其表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和組織學(xué)分級(jí)呈明顯正相關(guān)，可能介導(dǎo)了乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其進(jìn)展，通過檢測(cè)HIF－1α、CAⅨ的表達(dá)有助于評(píng)估乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及預(yù)后判斷。

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