Wnt信號通路誘導腫瘤細胞上皮間質轉化的研究進展

朱智杰，阮君山，李 堯，陸 茵，2，鄭仕中，2，王愛云，2，陳文星，2

(1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210029;2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京 210046)

上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞在形態學上發生向間質細胞表型的轉變并獲得遷移能力的過程［1］。在EMT過程中，細胞會失去極性、與周圍細胞和基質的接觸減少，細胞的遷移和運動能力增強，同時細胞表型發生改變，出現間質細胞的特性。EMT是胚胎早期發育和器官生成中的一個極其重要的過程，同時傷口愈合以及許多惡性上皮腫瘤發展的過程也與EMT密切相關［2－3］。誘導EMT發生的信號通路中，Wnt信號通路是誘導上皮組織EMT產生的關鍵信號轉導通路。

Wnt信號具有重要的生理功能，在早期的胚胎生長發育過程中，Wnt信號通路是腦和神經系統形成的必要因素［4－5］。同時，Wnt信號與干細胞自我更新和分化調控也密切相關，Wnt信號通路對于造血干細胞的自我更新有著重要意義，還維持小腸組織的穩定性，調節骨密度以及脂肪細胞的分化［6］。然而，Wnt信號轉導途徑的失調與多種已知的高發性癌變有關［7］。根據Wnt蛋白轉導信號的方式不同，Wnt信號轉導可以分為經典Wnt信號通路(canonical Wnt signaling pathway)和非經典的Wnt信號通路(noncanonical Wnt signaling pathway)。如 Fig 1所示，經典 Wnt通路(Wnt/βcatenin通路)通過核內β鏈接蛋白(β-catenin)的累積，激活Wnt相關靶基因，這條通路中的成分(β-catenin，Axin)活化過度或者失調可引起腫瘤的形成;非經典通路又主要分為兩條:(1)Wnt/Ca2+通路由Wnt5A和Wnt11激活，通過鈣調蛋白依賴的激酶Ⅱ(CamkⅡ)、鈣調蛋白敏感的蛋白磷酸酶(Calcn)和T細胞核因子NF-AT的作用，引起細胞內Ca2+增加并激活蛋白激酶C(PKC)，調節腫瘤細胞之間的黏附。(2)細胞平面極性通路(Wnt/polarity通路)，又稱Wnt/PCP途徑或Wnt/Jun激酶途徑，涉及RhoA和Jun激酶(JNK)，此通路主要調控腫瘤細胞骨架的重排，控制細胞骨架的形成，參與腫瘤細胞的變形、遷移以及腫瘤細胞的極性變化等［8］。近幾年國內外的研究發現，Wnt的經典和非經典通路均參與EMT的誘導過程，不同Wnt信號通路之間以及Wnt信號與其他通路間有時還存在相互作用(cross talk)，這使其分子機制變得異常復雜。但Wnt信號通路是EMT最主要的誘因之一，本文著重論述近幾年關于Wnt信號通路誘導腫瘤EMT過程的重要進展，期望能對腫瘤研究的科學工作者提供借鑒。

1 Wnt/β-catenin通路在腫瘤上皮間質轉化中的作用

Wnt經典信號通路調節由胞質β-鏈接蛋白的磷酸化/降解引起。如Fig 1所示，在沒有Wnt信號時，大部分β-鏈接蛋白與E鈣黏附蛋白(E-cadherin)和細胞骨架蛋白(actin)結合維持其穩定性，少部分與大腸腺瘤樣蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、GSK3β及軸蛋白(axin)結合形成“降解復合物”，隨后進行泛素化和蛋白酶體介導的降解，使胞質內游離的β-catenin維持在低水平，不能進入核內激活作用靶點。在有 Wnt信號存在時，形成 Wnt蛋白、Frizzled和LRP5/6的復合物，信號通過作用于胞質內蓬松蛋白(Dvl)，導致細胞質中的降解復合物失去活性，并發生解離，使之不能再磷酸化β-catenin，β-catenin在細胞質的水平得到累積，轉位進入細胞核，在胞核與T細胞因子(TCF)/淋巴增強子結合因子(LEF)轉錄因子結合，調節靶基因的表達［9］。

β-catenin進入細胞核并堆積在核內，與腫瘤細胞EMT的發生以及腫瘤轉移密切相關。Prasad等［10］研究發現，波形蛋白表達與細胞核β-catenin以及胞質內蓬松蛋白(Dvl)之間有明顯的關聯，證明了在浸潤性乳腺導管癌(IDCs)中Wnt/β-catenin信號通路誘導 EMT發生的重要性。Prasad等［11］又進一步通過對98例臨床浸潤性乳腺導管癌樣本中Wnt/β-catenin信號通路的表達方式以及關鍵組分E鈣粘素、Slug和GSK3β之間關系的分析發現，Slug作為介導EMT發生的重要分子，可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路降低E鈣粘素，首次提供了臨床證據支持在浸潤性乳腺導管癌的EMT中，Wnt/β-catenin信號通路的表達上調。Zhao等［12］研究發現，使用缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)可以誘導前列腺癌細胞(LNCaP)發生EMT。細胞的間質標志物呈現高表達，上皮標記物則低表達;而轉染β-catenin的短發卡RNA(shRNA)后，細胞上皮標記物E鈣粘素表達增加，間質標記物N-鈣粘素(N-cadherin)，波形蛋白(vimentin)以及基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達則明顯下降，通過β-catenin的shRNA作用，LNCaP細胞的EMT發生了逆轉，證明了Wnt/β-catenin信號通路作為一個必要的內源性信號，可能直接控制HIF-1α 誘導 EMT 的發生。Stemmer等［13］研究發現，Wnt/β-catenin信號激活可以使Slug、Snail、Twist等表達增加，降低E鈣粘素并形成EMT。而在結腸癌細胞系的EMT過程中，Snail過表達可以增加Wnt信號靶基因的表達，Snail通過其N端與β-catenin相互作用，進一步激活Wnt信號下游靶基因的表達，從而形成Wnt信號激活的正反饋。

Fig 1 Wnt signaling pathway

2 非經典Wnt通路在腫瘤上皮間質轉化中的作用

目前已經發現了多種Wnt蛋白，其并不通過β-catenin在核內積累而產生Wnt信號，包括Wnt5A、Wnt11在內的多種Wnt蛋白是通過非經典Wnt信號發生轉導。深入的研究發現，Wnt非經典信號通路也參與腫瘤細胞EMT的誘導過程。

Dissanayake等［14］通過對黑色素瘤 EMT的研究發現，Wnt5A可以增加Snail以及波形蛋白，減少E鈣粘素的表達。使用蛋白激酶C(PKC)抑制劑后加入人重組Wnt5A與腫瘤細胞共培養，可以明顯抑制Snail的表達，提示Wnt5A是通過PKC途徑誘導黑色素瘤EMT和轉移的。Fort等［15］對神經嵴(NC)細胞中 Rho家族研究發現，Wnt的應答基因RhoU/wrch1在顱神經嵴細胞(CNC)中表達，RhoU通過激活JNK調控Wnt/polarity通路發生作用，細胞中的RhoU的表達水平在EMT形成以及腫瘤的轉移過程中扮演重要角色。體外研究還發現，RhoU與PAK1和Rac1共同在EMT和腫瘤轉移過程中起作用［16］。Chen等［17］對小獵犬腎上皮細胞中EMT的研究發現，細胞中Wnt5A的表達增加，使用siRNA沉默Wnt5A后發現細胞的遷移能力明顯下降。在EMT過程中還發現RhoA，Rac以及JNK等調控因子的表達都上調，說明Wnt5A還可以通過細胞平面極性通路誘導EMT的產生。

3 經典和非經典Wnt信號通路共同作用

在某些情況下，一種Wnt蛋白的下游信號可以是經典Wnt信號，也可以是非經典Wnt信號，所以有些EMT的產生是通過Wnt的經典和非經典通路共同誘導的。

von Gise等［18］對腎母細胞腫瘤基因(WT1)的研究發現，WT1可以調控心外膜上的上皮間質轉化，通過使用遺傳譜系跟蹤法獲得缺少WTI基因［WT1(KO)］的心外包膜和心外包膜衍生物。研究發現，WT1(KO)不會發生EMT，一方面WT1(KO)的心外包膜上Wnt/β-catenin信號通路的重要成分Lef1和Ctnnb1(β-catenin)表達下降，該通路下游的Axin2、Cyclin D1和Cyclin D2的活性也降低;另一方面，WT1(KO)與具有WT1的心外膜相比，Wnt5A和Raldh2表達明顯下降，說明WT1可以通過經典和非經典的Wnt通路共同調控心外膜的 EMT。Iwai等［19］發現，在口腔鱗狀細胞癌(SCC)胞質中堆積大量β-catenin，不但增加Tcf/Lef介導的轉錄活性，還上調Wnt/β-catenin信號的靶基因MMP-7，并且增加Rho家族Cdc42和Rac的水平，誘導上皮間質轉化，提高口腔鱗狀癌細胞的侵襲和遷移。Chung等［20］報道，分泌型卷曲相關蛋白SFRP1和SFRP2在宮頸癌CaSki細胞中能引起Wnt信號的衰減，降低β-catenin在細胞核內的異常堆積，抑制癌細胞的生長，同時還能增加E鈣粘素并降低Slug、Twist和Snail的表達。而β-catenin在CaSki或者HeLa3rd細胞胞質中呈現出不同的堆積狀態，提示SFRP1和SFRP2通過不同的Wnt信號產生作用。

Tab 1 信號通路在不同腫瘤中的分布

4 Wnt信號通路與其他信號通路的相互作用

Wnt信號通路作為誘導腫瘤EMT的重要信號，還與TGF-β、PI3K/Akt、Notch等其他信號通路有著一定程度的相互作用(cross talk)。通過對Wnt信號通路與其他信號的相互作用的研究，可以進一步了解EMT的機制的復雜性，同時也為如何逆轉EMT提供了思路。

4.1Wnt與TGF-β信號通路Scheel等［21］最新研究證實在永久化人乳腺上皮細胞(HMLE)中，經典及非經典Wnt信號通路與TGF-β協同作用誘導激活細胞EMT程序，之后以自分泌的方式維持最終的間質細胞狀態，證實在上皮細胞中下調內源的自分泌信號抑制因子可誘導細胞啟動EMT程序。反之，當在細胞中添加相關信號通路抑制劑時，發現自分泌信號破壞可導致原代永久化人乳腺上皮細胞遷移及自我更新受到抑制，并降低了轉化衍生物誘導的腫瘤形成及轉移。Qin等［22］在卵巢上皮細胞中，通過生物信息學方法發現Wnt通路下游的LEF1可作為TGF-β通路中Smad蛋白的共調節因子，共同參與對靶基因的轉錄調節，從而連接Wnt和TGF-β/Smad兩條信號通路。

4.2Wnt與PI3K/Akt通信號通路Wnt與 PI3K/Akt信號通路在EMT過程中對GSK3磷酸化的不同作用，同時通過刺激Wnt/Disheveled信號可以進一步激活Akt的活性，并且Akt可能作用于β-catenin的轉錄以及磷酸化過程，然而兩個信號通路在EMT過程的直接相互作用則有待進一步的研究［23］。

4.3Wnt與Notch信號通路許多文獻都報道了Wnt和Notch通路的交聯，Niessen等［24］報道在上皮細胞中，Snail2是Notch信號通路的一個靶基因，而Notch信號則可以直接上調 Slug，促進 EMT的形成。Devgan等［25］的研究揭示Notch信號對皮膚角質細胞β-catenin有調節作用，Notch通路能夠上調p21基因的表達，而p21蛋白可以與轉錄因子E2F-1共同作用于Wnt4基因的啟動子，下調Wnt4蛋白的表達。

4.4Wnt與Hedgehog信號通路研究發現，Hedgehog信號可以上調間質細胞中SFRP1、SNAI1(Snail)以及ZEB1和ZEB2的水平［26］。Yang等［27］研究發現，在小鼠基底細胞癌(BCC)的上皮芽和錯構瘤中，Wnt/β-catenin信號通路能夠誘導癌基因M2SMO表達，進一步激活Hedgehog信號。

5 基于Wnt信號通路誘導EMT的抗腫瘤藥物

由于EMT在腫瘤的發展過程中扮演重要角色，阻斷甚至逆轉EMT可為腫瘤的的治療提供新的思路，通過藥物調節Wnt信號通路，可能成為抗腫瘤的新方法，同時對抗腫瘤藥物的發展具有積極的推動作用。

閆喆等［28］研究發現厄貝沙坦可以下調 Wnt4、α-SMA及β-catenin核蛋白表達，升高E鈣粘素的表達水平，抑制Wnt/β-catenin信號途徑誘導的腎小管上皮細胞EMT。趙士彭等［29］報道塞來昔布通過COX-2依賴或非依賴途徑抑制Wnt信號通路從而抑制結腸癌移植瘤的生長，誘導實現細胞的凋亡。黃偉平等［30］發現舒林酸通過下調 β-catenin抑制肝癌細胞的Wnt信號通路，下調 cyclinD1的表達。馬駿飛等［31］研究發現布洛芬可以使肝癌細胞HepG2在細胞核中β-catenin堆積減少，胞質中增多，通過調控Wnt/β-catenin信號通路，影響β-catenin的表達和定位，調節下游相關靶基因的轉錄。

6 結語

上皮細胞發生EMT獲得間質細胞特性從而使腫瘤細胞進一步發生侵襲和轉移，在腫瘤的發展過程中扮演了重要的角色，而Wnt信號則是誘導 EMT發生的重要途徑之一。EMT并非永久的，在一定的條件下可以發生阻斷甚至逆轉，通過對Wnt信號誘導EMT過程的研究，對我們進一步揭示腫瘤的本質，尋找臨床有效治療手段提供了新思路。同時，EMT的發生以及Wnt信號通路中的信號分子表達異常還可以作為早期腫瘤診斷的標記，讓我們能夠盡早及時的趨利避害。而且不同的Wnt信號在不同的腫瘤細胞中可能存在特殊的分布(如表1)，可能與不同的腫瘤微環境有關。對Wnt信號與其他信號在EMT過程中的相互作用研究讓我們更加全面了解EMT復雜性的同時還發現有些信號分子可以作為靶點來調節Wnt信號。因此，了解Wnt信號通路對EMT的誘導過程，對于如何有效阻斷或逆轉EMT的發生以及腫瘤的診斷和治療都有著重要意義。

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