補體旁路激活導致內皮細胞活化和損傷

孫黔云，李 敏，葉巧玲，李紅玲

(1.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，2.貴州省人民醫院呼吸疾病研究所，貴州貴陽 550002)

補體是免疫系統的重要組成部分，在機體天然防御、免疫調控中發揮重要作用［1－2］。但補體的過度激活會引發炎癥和組織損傷［2－4］，尤其是補體替代途徑的過度激活在一系列疾病和病征的發生發展中扮演了重要角色［5－6］。而補體引發炎癥和組織損傷的關鍵在于其激活后對血管內皮細胞所產生的作用。以往報道的補體作用內皮細胞相關研究多為關注單一補體活化成分影響臍靜脈內皮細胞的作用，而對病理生理條件下補體激活產物作用和影響微血管內皮細胞的研究報道極少。為進一步認識和理解補體過度激活對血管內皮細胞的影響及在相關病理中的作用，為相關新藥的篩選和評價提供參考依據以及合適的細胞模型，本文報道了補體替代途徑的激活對人微血管內皮細胞產生的活化和損傷作用。

1 材料與方法

1.1材料人微血管內皮細胞株HMEC由本實驗室傳代培養，DMEM細胞培養基和胎牛血清為美國Hyclone公司產品;人 P-selectin、E-selectin、ICAM-1、MCP-1、IL-8測定ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒為江蘇碧云天生物技術研究所產品;caspase-8螢光檢測試劑盒為美國Promega公司產品;健康人混合血清(normal human serum，NHS)由本實驗室健康志愿者獻血制備，分裝保存于－80℃，經補體活性檢測后備用;滅活人血清(inactivated normal human serum，INHS)采用標準方法制備;眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)的制備和活力單位測定同已發表文獻［7］。其它試劑均為符合實驗要求的國產或進口試劑。

1.2主要儀器設備Forma 3111 CO2培養箱和Revco超低溫冰箱(美國Thermo公司);Nikon TS100倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司);GloMax化學發光檢測儀(美國Promega公司);Bio-Rad 550酶標儀(美國 Bio-Rad公司)。5810R冷凍離心機(德國Eppendorf公司);Elix純水系統和Milli Q超純水系統(美國Millipore公司)。

1.3方法

1.3.1補體激活物的制備將NHS與CVF(6.5×104U·L－1)等體積混合，37℃水浴孵育 30 min，將孵育物(CVF-activated complement，以下簡稱CAC)分裝，凍存于 －80℃備用。實驗中采用 INHS與CVF的孵育混合物作為CAC的對照。

1.3.2補體激活誘導內皮細胞表達P-selectin的作用

1.3.2.1量效作用測定 將HMEC細胞以4.5×103cells·well－1接種于 96 孔板，培養 24 h，棄培養液，加入含體積分數分別為5%、10%、20%、30%、40%CAC 的無血清DMEM 培養基200 μl，37℃ 培養20 min，取培養上清，2 000 r·min－1離心 10 min，取上清液，按試劑盒推薦步驟進行P-selectin測定。

1.3.2.2時效作用測定 將HMEC細胞以4.5×103cells·well－1接種于 96 孔板，培養 24 h，棄培養液，加入含30%CAC的無血清DMEM培養基200 μl，37℃分別培養 5、10、20、30、60 min，取培養上清，2 000 r·min－1離心 10 min，取上清液，測定 P-selectin。

1.3.3補體激活對HMEC表達E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8的影響將HMEC細胞以4.5×103cells·well－1接種于 96 孔板，培養 24 h，棄培養液，加入含30%CAC的無血清DMEM培養基200 μl，37℃培養不同時間，取培養上清，按試劑盒推薦步驟進行E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8測定。

1.3.4補體激活對HMEC的損傷情況將HMEC細胞以4.5×103cells·well－1接種于96孔板，培養24 h，棄培養液，加入含30%CAC的無血清DMEM培養基200 μl，各組別分別培養不同時間，按試劑盒推薦步驟分別檢測細胞釋放LDH、NO和caspase-8活化的情況，并采用MTT法測定細胞增殖活性。

1.4統計學分析實驗數據以±s表示。采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果

2.1補體激活誘導內皮細胞表達P-selectin補體激活產物能刺激內皮細胞瞬時釋放P-selectin。在血清體積分數為15%、作用時間為20 min時，這種釋放作用達到最大(Fig 1)。

Fig 1 P-selectin expressed by endothelial cells after exposure to activated complement(n=3)

2.2補體激活誘導HMEC表達E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8的作用補體激活產物能刺激內皮細胞上調表達 E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8(Fig 2)。

2.3補體激活對內皮細胞的損傷作用補體旁路激活能導致內皮細胞釋放LDH增加(Fig 3)，凋亡信號caspase-8的活化出現上調，在6～12 h有明顯的增強(Fig 4)。同時，NO釋放下調(Fig 5)。經激活的補體作用后，內皮細胞的生長受到一定程度的抑制(Fig 6)。

Fig 2 Expression of proinflammatory molecules in endothelial cells after exposure to activated complement(n=3)

Fig 3 LDH released from endothelial cells after exposure to activated complement(n=4)

Fig 4 Activation of caspase-8 in endothelial cells after exposure to activated complement(n=4)

3 討論

補體的激活分為經典、替代和凝集素途徑，而不同的活化途徑均有共同的活化末端路徑(C5-C9)。因此，獲得補體替代途徑激活所產生的所有特異性產物是本研究目標達成的關鍵。為此，我們采用了CVF來激活血清補體。CVF是來源于眼鏡蛇毒的一種高度特異的補體替代途徑激活蛋白。在血清環境中，CVF與補體B因子特異結合，形成CVFB復合物，CVFB經D因子的特異識別和酶切，形成替代途徑C3/C5轉化酶CVFBb，CVFBb可持續激活補體替代途徑。這種激活模式與病理生理條件下體內補體替代途徑的過度激活高度一致，其產物對血管內皮細胞的作用和影響可以很好地模擬體內補體旁路過度激活對血管內皮細胞產生的效應。因此，這個組合的實驗體系也為開展與補體相關的內皮細胞保護及活性物質篩選研究提供了一個合適的細胞模型。同時，通過該細胞模型的研究，也有助于認識CVF高效激活補體導致血管內皮損傷和炎癥的作用在眼鏡蛇蛇傷毒性機制中所扮演的角色。

Fig 5 Effect of complement activation on production of NO by endothelial cells(n=4)

Fig 6 Effect of complement activation on cell proliferation(n=3)

據此，本研究觀察了補體旁路激活對內皮細胞的影響和作用。結果表明，補體旁路激活導致內皮細胞瞬時釋放P-selectin，并上調表達黏附分子E-selectin、ICAM-1和趨化因子 MCP-1、IL-8，使內皮細胞釋放LDH增加，caspase-8活化上調，NO表達下調，細胞生長受到抑制。補體作為機體天然防御系統的重要一員，其正常可控的活化是實現免疫防御和調控作用的前提。但在諸多病理生理情況下，補體的活化會失控，從而引發炎癥和損傷。補體的激活，尤其是旁路激活，在一系列疾病和病理損傷中扮演了重要角色。而血管內皮細胞無疑會成為補體激活后的重要靶標。在本研究中可以看到，補體旁路激活后首先會導致內皮細胞瞬時表達P-selectin，這種表達在數分鐘內即有明顯的變化，在20 min時升至高峰。隨后數小時內，內皮細胞開始上調表達E-selectin、ICAM-1、MCP-1、IL-8 這類通過轉錄調控表達的黏附分子和炎癥介質。補體替代途徑的激活，會產生C3a、C3b、C5a以及攻膜復合物(membrane attack complex，MAC)等多種活化產物。C5a不僅能刺激臍靜脈內皮細胞快速表達P-selectin，而且還能使多種黏附分子、細胞因子和趨化因子上調表達［8］。亞溶胞劑量的攻膜復合物 MAC能誘導 E-selectin、ICAM-1、MCP-1、IL-8 的表達上調［9－10］，而沒有溶胞活性的iTCC(inactive terminal complement complex)也具有同樣的作用［11］。P-selectin、E-selectin、ICAM-1是順序介導中性粒細胞與內皮細胞黏附及跨膜遷移的重要分子，MCP-1和IL-8則具有促進中性粒細胞、巨噬細胞向內皮細胞聚集和黏附的功能。本研究結果顯示，在受到補體旁路激活產物的刺激后，人微血管內皮細胞順序出現了典型的內皮細胞I型和II型活化［12］。血管內皮細胞不僅構成了血管平滑肌組織與血液間的物理性屏障，而且還是具有諸多重要生理調節活性的功能細胞。上述的活化刺激會導致內皮細胞形態與功能的變化，而這種活化一旦持續，就會使內皮細胞出現損傷和凋亡，從而破壞血管內皮的完整性，引發后續的炎癥和損傷。

激活的補體旁路產物不僅刺激內皮細胞活化，而且也對內皮細胞產生損傷。從本實驗看到，內皮細胞經CAC作用后，LDH釋放增加，提示內皮細胞膜出現損傷和泄漏。這可能是CAC與內皮細胞接觸后在細胞膜上生成了少量具有溶胞活性的MAC所致。而caspase-8的活化上調，表明CAC對內皮細胞的刺激和作用會導致一定程度的凋亡，使內皮細胞的增殖受到一定程度抑制。同時，內皮細胞分泌NO明顯減少。NO是體內重要的信號分子，具有多種重要的生理或病理生理作用［13］。血管內皮細胞功能的紊亂，會導致NO的合成障礙［13］。以上結果提示，補體旁路激活會影響和損傷內皮細胞的正常功能，進而產生相關的病理生理效應。而在相關疾病和病理損傷中，采用合適有效的補體抑制劑阻斷補體相關激活產物的形成，從而抑制或減輕內皮細胞的活化和損傷，則成為干預和治療的關鍵。因此，本實驗結果有助于進一步加深對補體激活引發炎癥和損傷效應的認識和理解，為補體相關疾病及病理損傷的機制和干預治療新策略以及相關新藥的研究提供有益的參考和依據。

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