白芍總苷對膠原性關節炎大鼠滑膜β抑制蛋白的影響與其抑制滑膜細胞增殖的關系

吳華勛，陳鏡宇，汪慶童，孫嫵弋，常 艷，吳育晶，張玲玲，魏 偉

(安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥理學教育部重點實驗室，安徽省中藥研究與開發重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽省工程技術研究中心，安徽合肥 230032)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節滑膜炎癥為主要病理表現的慢性、系統性、自身免疫性疾?。?］。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)是從白芍干燥根中提取的有效部位，研究表明［2－3］，TGP可以抑制關節炎大鼠滑膜細胞增殖，調節免疫功能，在臨床上治療類風濕關節炎已經發揮了重要作用?；ぱ椎暮诵膯栴}之一是滑膜細胞異常增殖，盡管對其的原因研究較多，涉及到多個細胞因子的作用以及 NF-κB、MAPKs信號的參與等，但G蛋白偶聯信號在其中的作用較明顯。研究發現，G蛋白-AC-cAMP信號通路介導了實驗性關節炎大鼠滑膜細胞的異常增殖，TGP能明顯抑制實驗性關節炎大鼠滑膜組織中Gi的表達，促進Gs的表達，提高細胞內cAMP水平，從而降低滑膜細胞的增殖與分泌［4－6］。

G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)是最大的膜蛋白家族，是重要的藥物作用靶點，在炎癥免疫應答中起著重要的信號轉導作用［7］。β抑制蛋白分為β抑制蛋白1、2兩種亞型，廣泛存在于各種細胞中，調節絕大多數GPCRs的活性，促進GPCRs內化和脫敏［8］。其中β抑制蛋白1在胞質和胞核中都有表達，除參與GPCRs的調節，還可能通過核內功能調節自身免疫病;而β抑制蛋白2僅在胞質中表達，還參與了腫瘤壞死因子受體、TLR/IL-1R/RANK等信號通路的調節［9］。研究發現［10］，在膠原性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠滑膜組織中β抑制蛋白2表達在致炎后d 21、d 28明顯增加，d 28達到峰值，與病程發展有相關性，可能與其影響G蛋白-cAMP信號通路發生異常改變有關。另有文獻報道，采用β抑制蛋白2基因敲除小鼠，誘導造模，結果發現β抑制蛋白2基因敲除小鼠影響了關節炎的嚴重程度，這與其對滑膜細胞炎癥的調整有關［11］。TGP對滑膜β抑制蛋白表達的影響是否與其抑制滑膜細胞增殖作用相關，未見文獻報道。本文主要探討TGP對CIA大鼠滑膜β抑制蛋白1、2表達的影響與其抑制滑膜細胞增殖的關系，旨在進一步揭示TGP治療作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1動物Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量(120±20)g，♂，由安徽醫科大學動物實驗中心提供，合格證號:皖醫實動準字第01號。

1.2藥物與試劑TGP:棕色粉末，由亳白芍干燥根提取、純化后得到;由安徽醫科大學臨床藥理研究所化學室提供，給藥時以質量濃度5 g·L－1羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度;雷公藤多苷(GTW)，上海復旦復華藥業有限公司，實驗時均以質量濃度5 g·L－1羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度;卡介苗(BCG):衛生部上海生物制品所產品，用前80℃滅活;雞Ⅱ型膠原(CCⅡ):上海本草生物醫學工程所;羊抗β抑制蛋白1抗體(K16，sc-9182):購于Santa Cruz公司;小鼠抗 β抑制蛋白2抗體 (H-9，sc-13140):購于Santa Cruz公司;辣根酶兔抗山羊IgG(H+L)，辣根酶山羊抗小鼠IgG(H+L)購于北京中杉公司;β-actin選購于Sigma公司;

1.3方法

1.3.1大鼠CIA模型的建立將 CCⅡ溶于0.1 mol·L－1的冰醋酸中，濃度為 0.4 g·L－1，將研缽置于冰袋上，研磨CCⅡ至充分溶解，置4℃冰箱過夜;再將80℃、1 h滅活的BCG溶于液體石蠟中，配成0.4 g·L－1的完全弗氏佐劑(CFA)，將二者等體積混合、乳化，制成CCⅡ乳劑(即每1 ml中含0.2 mg CCII)。將該乳劑于大鼠的足爪、背部、尾根部多點皮內注射致炎(1 ml/只)。注射致炎后d 7，再用上述CⅡ乳劑背、尾部皮內注射加強(1 ml/只)。正常組用生理鹽水同法注射。

1.3.2實驗分組和給藥方案SD大鼠隨機分為6組:正常對照組，CIA模型組，TGP低、中、高劑量組(25、50、100 mg·kg－1)和陽性對照組(GTW 40 mg·kg－1)。各用藥組于致炎后d 14～28 ig給藥，qd，正常對照組和CIA模型組ig等容量的5 g·L－1羧甲基纖維素鈉。

1.3.3關節炎指數(arthritis index，AI)評分致炎后d 14、d 20、d 28觀察并記錄大鼠全身關節病變情況，每只足趾按下列標準評分:0分:正常;1分:踝關節出現紅斑和輕微腫脹;2分:踝關節到趾關節或掌關節紅斑和輕微腫脹;3分:踝關節到跖趾關節或掌關節紅斑和中度腫脹;4分:踝關節到趾關節出現紅斑和重度腫脹。未注射膠原的其余3個關節的評分累計之和即為每只大鼠的AI。

1.3.4滑膜細胞增殖反應的測定采用MTT法。體內給藥各組大鼠滑膜細胞經培養后，制備細胞懸液(5 ×109cells·L－1)，加至96孔培養板，每孔100 μl，設6 個復孔，再加入 100 μl含 8 mg·L－1LPS 的DMEM培養液，置于37℃、5%CO2培養箱培養，培養72h，終止培養前4 h各孔加MTT(5 g·L－1)溶液20 μl繼續培養，培養結束后棄去上清液，加入DMSO(100 μl/孔)，振蕩3 min后于酶標儀490 nm波長處測吸光度(absorbance，A值)。以正常大鼠滑膜細胞為對照組，每組以6孔的均值表示其結果。

1.3.5β抑制蛋白表達的測定處死大鼠，取滑膜組織，提取蛋白行SDS-PAGE，轉移至PVDF膜后，用質量濃度50 g·L－1脫脂牛奶室溫封閉2 h;室溫孵育一抗2 h，PBS洗3次，每次10min;室溫孵育二抗2 h，PBS洗3次，每次10 min;ECL試劑盒顯色。結果采用凝膠成像系統掃描后，以特異性條帶濃度與面積的乘積為有效值，反映蛋白表達水平。

1.3.6統計學分析數據分析用SPSS17.0軟件處理，數據以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1TGP對CIA大鼠關節炎足爪指數評分的影響致炎后d14，對CIA大鼠關節炎指數進行評分，CIA模型大鼠足爪分值不斷升高，到d 28達高峰，與足爪腫脹時間一致。TGP(25、50、100 mg·kg－1，d 14 ～28)、GTW(40 mg·kg－1，d 14 ～28)連續灌胃給藥14 d，可明顯抑制CIA大鼠多發性關節炎評分分值(Tab 1)。

Tab 1 Influence of TGP on arthritis index in CIA rats(±s，n=9)

Tab 1 Influence of TGP on arthritis index in CIA rats(±s，n=9)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CIA group

Group Dose/mg·kg－1 Arthritis index d 20 d 24 d 28 CIA － 3.667 ±1.231 5.678 ±1.435 7.000 ±1.279 TGP 25 2.454 ±1.086* 3.300 ±1.712＊＊ 2.636 ±1.054＊＊50 2.300 ±0.948＊＊ 3.181 ±1.250＊＊ 2.600 ±1.776＊＊100 2.100 ±0.934＊＊ 2.600 ±1.577＊＊ 2.012 ±0.911＊＊GTW 40 2.500 ±1.080* 2.610 ±1.567＊＊ 2.512 ±1.269＊＊

2.2TGP體內用藥對CIA大鼠FLS增殖反應的影響末次給藥后分離大鼠滑膜組織，經膠原酶－胰蛋白酶消化法分離得到FLS，取第3代FLS，MTT法檢測其增殖反應。結果表明，CIA大鼠FLS增殖反應增強，TGP(50、100 mg·kg－1，d 14 ～ 28)和GTW(40 mg·kg－1，d 14 ～28)可不同程度的抑制FLS增殖反應(Tab 2)。

Tab 2 Influence of TGP on synoviocyte proliferation in CIA rats(±s，n=6)

Tab 2 Influence of TGP on synoviocyte proliferation in CIA rats(±s，n=6)

#P＜0.05 vs normal;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CIA.

Group Dose/mg·kg－1 Synoviocyte proliferation(A)Normal － 0.110 ±0.020 CIA － 0.163 ±0.037#TGP 25 0.136 ±0.034 50 0.116 ±0.023*100 0.107 ±0.017＊＊GTW 40 0.112 ±0.020*

2.3TGP體內用藥對滑膜組織β抑制蛋白表達的影響大鼠致炎后d 28處死，分離滑膜組織，用Western blot法檢測滑膜組織中β抑制蛋白1、2表達水平。結果表明，與正常組相比，模型組β抑制蛋白2表達明顯升高，β抑制蛋白1無明顯變化;TGP(100 mg·kg－1)能明顯減少致炎后β抑制蛋白2的表達，而對β抑制蛋白1表達無明顯影響(Fig 1)。

Fig 1 Effects of TGP on expression of β-arrestins in synovial tissue of CIA rats(±s，n=4)

2.4TGP對CIA大鼠滑膜β抑制蛋白表達的影響與其抑制滑膜細胞增殖作用相關性分析TGP對β抑制蛋白1表達無影響，故主要分析TGP對CIA大鼠滑膜β抑制蛋白2表達的影響與其抑制滑膜細胞增殖作用的相關性。經相關性分析，TGP對CIA大鼠滑膜β抑制蛋白2表達的影響與其抑制滑膜細胞增殖作用呈高度相關(r=0.88)，隨著TGP濃度的增加，其下調β抑制蛋白2表達的作用增強，抑制滑膜細胞增殖作用增加，逐漸趨于正常組的β抑制蛋白2表達水平及滑膜細胞增殖狀態(Fig 2)。

3 討論

G蛋白偶聯信號轉導通路的異常在炎癥免疫性疾病進程中起重要作用［12］，其中GPCRs－G蛋白－cAMP信號通路參與多種生理活性的調節，包括對細胞增殖與分化的調節。細胞的異常增殖、快速分化等與細胞內的cAMP改變有關，cAMP水平增高可抑制細胞的增殖效應。

Fig 2 Correlation analysis between effects of TGP on expression of β-arrestin 2 and on synoviocyte proliferation(A)

β抑制蛋白是GPCR信號的負調控者，與G蛋白偶聯受體激酶(G-protein-coupled receptors kinases，GRKs)協同促進GPCRs內化和脫敏。β抑制蛋白的功能變化將影響GPCRs介導的信號轉導的效應［13］，從而可能影響 cAMP水平及細胞的增殖活性。另外，β抑制蛋白可通過調節 NF-κB、MAPKs信號通路參與許多炎癥免疫性疾病的發病過程。

本實驗研究發現，CIA大鼠滑膜β抑制蛋白2表達升高，TGP對CIA大鼠滑膜β抑制蛋白2表達的影響與其抑制滑膜細胞增殖作用呈高度相關。本課題組以往研究也發現，在CIA大鼠滑膜細胞中GRKs的表達在炎癥高峰期上調，與病程發展有相關性［14］。根據相關實驗結果，我們推斷關節炎癥期間，各種致炎細胞因子水平升高，長期或反復刺激后，可能引起β抑制蛋白2自身保護性的表達上調，以促進GPCRs與G蛋白脫偶聯，從而關閉了一些通過GPCRs的信號通路，導致G蛋白-cAMP信號通路發生異常改變，cAMP水平下降。TGP能下調β抑制蛋白2的表達，降低其對GPCRs與G蛋白的脫偶聯作用，恢復G蛋白-cAMP信號通路，從而發揮抑制滑膜細胞增殖，治療關節炎的作用。

此外，在RA中NF-κB是明顯活化的，它在RA炎癥、骨質破壞、細胞的增殖、血管翳的形成中起重要作用，β抑制蛋白表達的上調可以明顯抑制NF-κB活化;MAPKs在RA滑膜組織中表達升高，β抑制蛋白2可以作為支架蛋白，促進MAPKs通路的活化［10］;β抑制蛋白對這些通路的調整也可能參與了RA的發病過程，在下一步的工作中將進一步探討。

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