靈芝多糖抑制NADPH氧化酶表達(dá)防治大鼠動脈粥樣硬化

吳 鋒，孟國梁，常珊珊，徐濟(jì)良

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，江蘇南通 226001)

靈芝多糖(Ganoderma lucidum Polysaccharide，GLP)為多孔菌科真菌靈芝［Ganoderma lucidum(Leys.Ex Fr.)Karst］中提取出的以 β(1→3)糖苷鍵為主鏈的雜多糖［1］。筆者證實GLP可有效通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂減緩大鼠動脈粥樣硬化(AS)病程［2］，楊麗娟等［3］發(fā)現(xiàn)靈芝多糖肽對人臍靜脈內(nèi)皮有抗氧化損傷作用，而氧化應(yīng)激在AS發(fā)生發(fā)展過程中為主因之一［4］;所以本實驗以AS大鼠為實驗?zāi)Ｐ停^察GLP能否通過干預(yù)AS氧化應(yīng)激過程起到治療作用，并探討其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑GLP(江蘇安惠生物科技有限公司，含量82%)，膽固醇(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)，膽酸鈉(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)，丙基硫氧嘧啶(上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司)，維生素D3(上海通用藥業(yè)股份有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成生物工程公司)，活體組織氧化應(yīng)激活性氧(ROS)初級熒光測定試劑盒(genmed)，兔抗大鼠Nox4多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，兔抗大鼠p22phox多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2模型制作健康♂SD大鼠40只，體質(zhì)量180～200 g，南通大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)分為5組:正常對照組(CON)、AS模型組(AS)、GLP低、中、高劑量預(yù)防組(GLPL、GLPM、GLPH)。除正常組外其余4組以40 mg·kg－1劑量一次性腹腔注射維生素D3，喂高脂飼料(81.3%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%白糖、0.2%丙基硫氧嘧啶)。造模同時，GLP低、中、高劑量組每日分別以 GLP 125、250、500 mg·kg－1灌胃，正常組和模型對照組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3方法

1.3.1血清MDA、SOD檢測實驗12周后大鼠禁食12 h，20%烏拉糖腹腔麻醉，頸動脈插管取血，2 000 r·min－1分離血清，使用測試盒分別測定血清MDA、SOD含量。

1.3.2主動脈HE染色取大動脈(從主動脈弓至腹主動脈分叉處)，以生理鹽水沖洗殘血，用4%多聚甲醛溶液固定，逐級乙醇脫水，石蠟包埋切片，HE染色觀察主動脈內(nèi)膜情況。

1.3.3主動脈ROS測定手術(shù)取出血管，用刀片切碎組織，使用genmed活體組織氧化應(yīng)激活性氧(ROS)初級熒光測定試劑盒，在激發(fā)波長490 nm，散發(fā)波長520 nm下使用熒光酶標(biāo)儀檢測。

1.3.4免疫印跡Nox4、p22phox蛋白表達(dá)從主動脈弓至腹主動脈分叉處取主動脈，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液冰上提取蛋白，BCA法蛋白定量。8%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電流100 V;300 mA轉(zhuǎn)膜150 min;含5%脫脂奶粉TBST室溫封閉1 h;分別加Nox4和p22phox一抗4℃過夜;d 2加相應(yīng)的二抗室溫反應(yīng)1 h，掃膜并使用imageJ進(jìn)行灰度分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理利用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，計量資料用±s表示，組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。

2 結(jié)果

2.1大鼠血清MDA、SOD變化與CON組比較，AS組 MDA、SOD明顯升高(P＜0.01)，給藥組MDA、SOD較AS組均明顯下降(P＜0.01)，Tab 1。

Tab 1 Comparison of MDA，SOD levels of serum in rats of each group after 12 weeks’administration(±s，n=8)

Tab 1 Comparison of MDA，SOD levels of serum in rats of each group after 12 weeks’administration(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CON;##P ＜0.01 vs AS

Group MDA/μmol·L－1 SOD/NU·ml －1 CON 6.2 ±1.0## 160.23 ±32.58##AS 10.3 ±2.1* 206.01 ±39.34＊＊GLPL 8.7 ±0.9*## 178.04 ±15.23*##GLPM 7.1 ±1.2*## 170.85 ±23.07*##GLPH 7.3 ±1.6*## 174.57 ±33.78*##

2.2大鼠動脈粥樣斑塊改變?nèi)鏔ig 1所示，正常對照組大鼠胸、腹主動脈壁結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，內(nèi)膜連續(xù)而光滑，中層平滑肌層均勻無萎縮;動脈粥樣硬化模型組血管壁內(nèi)皮脫落，內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮下間隙增寬，內(nèi)彈力板斷裂，斑塊內(nèi)含有大量泡沫細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，纖維組織增生伴片狀鈣化，中膜平滑肌明顯萎縮;GLP預(yù)防組內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，結(jié)構(gòu)較完整，有少量脂質(zhì)沉積，少見內(nèi)彈力板斷裂。

Fig 1 HE staining of aorta(×400)

2.3主動脈ROS含量變化如Fig 2所示，AS組大鼠主動脈ROS含量明顯增高;與AS組比較，GLP各給藥組主動脈ROS含量均明顯下降(P＜0.01)。

2.4主動脈Nox4、p22phox表達(dá)變化如Fig 3免疫印跡結(jié)果顯示，AS組Nox4、p22phox蛋白表達(dá)量均較CON組增高(P＜0.01)，GLP干預(yù)后目的蛋白表達(dá)量明顯下降(P＜0.01)。

Fig 2 Ratio of aorta ROS’s optical density(±s，n=8)

Fig 3 Westen blot of vascular Nox4 and p22phox in rats of each group(±s，n=3)

3 討論

食餌性實驗AS動物模型通常用于模擬AS早期病變，病變首先呈現(xiàn)于主動脈［5］，實驗大鼠12周后形態(tài)學(xué)檢測大鼠主動脈顯示AS模型成立。血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平AS組較CON組明顯增高，MDA是ROS攻擊細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過氧化物，間接反映ROS的生成量和對組織損傷的程度［6］;結(jié)合主動脈ROS試劑盒檢測，均提示AS狀態(tài)下機(jī)體可能存在抗氧化防御機(jī)制的下降和體內(nèi)ROS生成的增多。靈芝多糖藥理學(xué)研究證實具有多種生物活性和藥理作用，除了主要的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用外，Zhao等［7］報道GLP可以通過抑制氧化應(yīng)激減少大鼠皮層原代神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧損傷，楊麗娟等［3］也發(fā)現(xiàn)靈芝多糖肽對人臍靜脈內(nèi)皮有抗氧化損傷作用，我們證實GLP具備減緩大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)阻遏主動脈粥樣硬化病程進(jìn)展的作用。

目前認(rèn)為SOD是體內(nèi)有效清除ROS的天然抗氧化酶［8］，實驗發(fā)現(xiàn)AS模型組SOD血清含量較正常組明顯上調(diào)，可解釋為病程中ROS增多后抗氧化酶的合成分泌在一定時程內(nèi)代償性增加，但實驗中提示這一代償機(jī)制不足以消除體內(nèi)積聚的過多ROS。GLP能夠有效降低主動脈ROS水平和血清MDA值，說明GLP可能是通過減少ROS的生成途徑阻遏動脈粥樣硬化病程。

NADPH氧化酶目前被認(rèn)為是血管內(nèi)生成ROS的主要酶體，NADPH氧化酶參與了AS的發(fā)生和發(fā)展全過程［9］。NADPH氧化酶，包含胞膜成分細(xì)胞色素b558(gp91phox和p22phox)和胞質(zhì)成分p47phox、p67phox及小的 GTP結(jié)合蛋白 rac等5個亞組分［10］，其中p22phox在各種細(xì)胞中都高表達(dá)。近年來至少發(fā)現(xiàn)了兩種新的gp91phox同工酶家族即Nox和 DUOX，Nox家族有 Nox1、Nox2(gp91phox)、Nox3、Nox4、Nox5等成員;在血管細(xì)胞中，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞主要表達(dá) Nox1和 Nox4。Sorescu等［11］發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化患者體內(nèi)，冠脈斑塊肩部存在大量過氧化物沉積，同時增高的 p22phox和 Nox2(gp91phox)結(jié)合后主要位于斑塊中的巨噬細(xì)胞，Nox4定位于血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞。血管生理學(xué)認(rèn)為，Nox家族是血管ROS的主要來源，并且血管平滑肌的NADPH氧化酶活性主要依賴于Nox4的表達(dá)［12－13］。血管平滑肌的分化表型在動脈粥樣硬化病理過程中起關(guān)鍵作用，Clempus等［14］Nox家族中只有Nox4在血管平滑機(jī)分化過程中起決定作用。我們實驗發(fā)現(xiàn)GLP藥物干預(yù)能夠有效下調(diào)主動脈p22phox和Nox4蛋白表達(dá)，這可能是GLP能夠下調(diào)AS大鼠主動脈ROS水平，起到防治動脈粥樣硬化作用的主要原因，但詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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