豚鼠心室肌細胞延遲整流鉀電流快慢成分在生長發育過程中的變化

朱曉冉，東 蕾，許彥芳

(教育部神經血管生物重點實驗室，河北省新藥藥理毒理重點實驗室，河北醫科大學藥理學教研室，河北石家莊 050017)

心肌細胞膜上的離子通道是維持心臟正常電活動的物質基礎，其結構和(或)功能的異常稱心臟離子通道病(cardiac channelopathies)［1］，包括基因突變所致的遺傳性離子通道病和后天獲得性離子通道病，后者見于疾病引發的通道功能改變、藥物抑制心肌通道等。通道功能紊亂常引發心律失常，嚴重者可致心源性猝死［1］。因此研究心臟離子通道正常生理功能調節和病理變化具有重要的意義。

參與心室動作電位復極化的鉀電流主要包括瞬時外向鉀電流(Ito)、延遲整流鉀電流(IK)及內向整流鉀電流(IK1)等［2］。Ito是小動物，如小鼠、大鼠心室肌細胞主要的復極電流，IK是包括人類在內的大動物心室復極化的主要電流，按照通道動力學的不同將其區分為快激活(IKr)和慢激活成分(IKs)。豚鼠心室動作電位及其離子通道與人類具有相似性［3］，是目前研究IKr和IKs的常用動物。研究表明，心肌多種鉀電流從出生到成年的發育過程存在明顯變化，然而關于豚鼠在幼年至成年的發育過程中心室肌細胞IKr和IKs兩種成分的變化尚未見報道。因此本研究采用膜片鉗技術，觀察延遲整流鉀電流IKr、IKs以及動作電位在豚鼠從新生、幼年到成年發育過程中的變化規律，為相關研究提供背景資料。

1 材料與方法

1.1動物及分組清潔級Hartley♂豚鼠，河北醫科大學實驗動物中心提供，新生豚鼠為出生后1～2 d，體質量50～80 g;幼年豚鼠出生后2周，體質量90～120 g;成年豚鼠約3個月，體質量250～350 g。

1.2心室細胞急性分離豚鼠心室細胞分離參照文獻方法進行［4］。先腹腔注射肝素2 000 U·kg－1后，戊巴比妥鈉(0.1 g·kg－1)腹腔注射麻醉。迅速取下心臟，經主動脈進行Langendorff逆行灌流。調整灌流速度使新生、幼年及成年心臟分別為2.5、4.5和7 ml·min－1。在37℃下用100%O2飽和的無鈣臺氏液灌流約5 min。臺氏液組成(mmol·L－1):NaCl 140、KCl 5.4、MgCl21、Glucose 10、HEPES 10(用NaOH調pH值至7.4)，之后用含0.4 g·L－1Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)的無鈣臺氏液循環灌流5～15 min，當心臟變得柔軟、松弛時用無鈣臺氏液沖洗5 min以終止反應，取下心臟。取左心室游離壁中層細胞保存于KB液中。KB液組成(mmol·L－1):KOH 80、KCl 40、KH2PO425、MgSO43、L-glutamic acid 50、taurine 20、EGTA1、Glucose 10、HEPES 10(用KOH調pH值至7.2)。細胞分離后6～8 h內用于電生理記錄。

1.3電生理記錄

1.3.1電流的記錄采用全細胞膜片鉗技術室溫(23℃ ～25℃)下記錄不同年齡段豚鼠心肌細胞的延遲整流鉀電流。細胞外液組成(mmol·L－1):NaCl 132、KCl 4、MgCl21.2、CaCl21.8、Glocose 5、HEPES 10(用NaOH調pH值至7.4)，電極內液組成(mmol·L-1):KCl 140、Mg-ATP 4、MgCl21、EGTA 5、HEPES 10(用KOH調pH值至7.2)。向外液中加入尼莫地平(Nim，1 μmol·L－1)，阻斷 L-型Ca2+通道，保持膜電位在－40 mV，使Na+通道和T-型Ca2+通道失活。在電壓鉗模式下，首先從－40 mV開始以階躍電壓10 mV的方式去極化到+50 mV，維持3 000 ms，而后保持 －40 mV 2 000 ms引出尾電流(IK-tail)，隨后給予 2 μmol·L－1E-4031，特異性阻斷IKr，記錄IKs。用IK-tail-IKs-tail計算IK的快激活成分(IKr)的大小。以鉗制電壓為－50 mV，超級化－10 mV得到的細胞電容電流積分值，計算出細胞電容，求得電流密度(pA/pF)。

1.3.2動作電位的記錄采用打孔膜片鉗技術記錄各年齡段豚鼠心室肌細胞的動作電位。細胞外液組成(mmol·L－1):NaCl 138、KCl 4、MgCl21、CaCl22、NaH2PO40.33、glucose 10、HEPES 10(用 NaOH 調pH值至7.4)，電極內液組成(mmol·L－1):谷氨酸鉀 120、KCl 25、MgCl21、CaCl21、HEPES 10(用NaOH調pH值至7.4)。先用電極尖部充以少量不含兩性霉素的電極內液，再用含兩性霉素(終濃度600 μg·L－1)的電極內液充灌電極，用微電極操縱器將電極推向細胞，負壓吸引形成高阻封接，5～10 min后轉到電流鉗下，細胞予以波寬10 ms，1Hz的方波，100% ～120%閾電流誘導動作電位，靜息膜電位達不到－70 mV的細胞棄去不用。測量動作電位參數，包括靜息電位、動作電位幅值、復極化90%需要的時間(APD90)等。

上述電生理數據的采集均在美國Axon公司的Axonpatch 200B放大器上由pClamp 8.1軟件通過Digidata 1322A數模轉換器轉換完成。玻璃微電極由Sutter公司的Model P-97型電極拉制器通過六步法拉制而成。電極拋光后，充灌電極內液，控制電阻在2～4 MΩ之間。實驗在室溫(20℃ ～25℃)下進行。

1.4試劑配制除特殊標注外，實驗中所用試劑均為Sigma公司產品。Chromanol 293B溶于DMSO配制成 10 mmol·L－1的儲備液，儲存于 －20℃;E-4031溶于水配制成1 mmol·L－1的儲備液，儲存于－20℃;Nimodipine溶于DMSO配制成100 mmol·L－1的儲備液，避光保存。

1.5數據處理采用Clampfit 9.0(美國 Axon公司)和Origin 7.5(美國Origin Lab公司)軟件進行圖像處理及數據分析。所有實驗結果用±s表示，采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間的顯著性差異。

2 結果

2.1發育過程中心室肌細胞IK的變化如Fig 1所示，豚鼠在新生、幼年及成年3個階段的發育過程中，延遲整流鉀電流IK的電流密度呈明顯遞增式變化，幼年組在－20～+50 mV范圍內高于新生組(P＜0.01);成年組在－0～+50 mV范圍內高于幼年組(P＜0.01)。

Fig 1 Current-voltage relationship for the IKtail current in neonatal(squares)，young(circles)and adult(triangles)guinea pig ventricular myocytes(n=8/8)(myocytes/guinea-pigs)

2.2發育過程中心室肌細胞IKs的變化區分延遲整流鉀電流兩種成分可以通過區分通道動力學差別或通過使用通道特異性阻斷劑的方法，近年的研究中多采用后者［4］。通過依次加入IKr、IKs特異阻斷劑，理論上應該全部阻斷IK才能證明用阻斷劑區分兩種電流成分的可靠性。為此，我們依次加入2 μmol·L－1E-4031 和30 μmol·L－1chromanol 293B，記錄電流阻斷情況。如Fig 2所示，IK在依次加入兩種阻斷劑后可被完全阻斷，表明記錄方法的可靠性。故加入IKr特異阻斷劑E-4031后剩余的成分即為IKs。比較新生、幼年及成年3個階段IKs的電流密度可見(Fig 3)，幼年動物在－30～+50 mV較新生動物明顯增加(P＜0.05或＜0.01)，成年動物又較幼年明顯增長(－10～+50 mV，P＜0.01)。

2.3發育過程中心室肌細胞IKr的變化與新生動物相比，幼年動物的IKr在去極化電壓－10 mV～+50 mV范圍內呈明顯增加(P＜0.01)。而幼年與成年相比，IKr的電流密度未見明顯改變(P＞0.05)。

2.4發育過程中心室肌細胞動作電位的變化在1 Hz的刺激頻率下，新生、幼年及成年豚鼠心室肌細胞靜息電位分別為(－80.1±1.5)、(－81.6±1.8)及(－78.9±1.3)mV(組間比較無明顯差別，P＞0.05);動作電位幅值分別為(127.9±2.1)、(129.3±3.0)及(131.7±2.5)mV(組間比較無明顯差別，P＞0.05);APD90分別為(159.7±9.8)、(188.4±14.3)及(203.8±12.8)ms，幼年組較新生組明顯延長(P＜0.01)，而成年又較幼年明顯延長(P＜0.01)(Fig 5)。可見，豚鼠在發育過程中心室肌細胞靜息電位和動作電位幅值未見明顯改變，而APD90隨年齡的增長逐漸延長。

Fig 2 Original current recordings in ventricular myocytes from neonatal，young and adult guinea pigs

Fig 3 Current-voltage relationship for the IKstail current in neonatal(squares)，young(circles)and adult(triangles)guinea pig ventricular myocytes(n=8/8)(myocytes/guinea-pigs)

3 討論

心室復極化的各種鉀電流存在明顯種屬差異，由于嚙齒類動物心肌細胞缺乏或具極少量的IKr和IKs，故豚鼠是目前研究延遲整流鉀電流的常用動物，但不同年齡發育階段延遲整流鉀電流和動作電位的變化情況目前尚不明確。我們的實驗結果表明，豚鼠心室肌細胞延遲整流鉀電流從新生、幼年到成年呈逐漸增加趨勢。先前Kato等［5］曾報道，豚鼠心室肌細胞IK從胚胎、新生至成年發育過程中呈增長趨勢，這與我們的實驗結果一致。區分IKr和IKs兩種成份顯示，盡管IKr和IKs均隨動物生長發育電流密度呈逐漸增加趨勢，但它們的變化方式不同，其中IKr在幼年階段即發育至成年水平，而IKs則從新生、幼年直至成年持續發育。以往的研究表明［6－7］，Ito在小動物伴隨動物出生后的發育過程明顯增大。主要維持動物靜息電位的IK1，在小鼠［6］，大鼠［7］和家兔［8］從胚胎期到成年的發育過程中電流密度也不斷增大。新生1 d的小鼠心室肌可記錄到IKr和IKs，3 d時IKs明顯增大，發育至成年后幾乎記錄不到IKr和IKs［9］。另有報道，新生犬心室肌細胞缺乏IKs［10］。上述的結果表明，不同的復極K+電流從新生至成年存在明顯不同的發育模式和種屬差異。

Fig 4 Current-voltage relationship for the IKrtail current in neonatal(squares)，young(circles)and adult(triangles)guinea pig ventricular myocytes(n=8/8)(myocytes/guinea-pigs)

Fig 5 Action potential recordings from neonatal，young and adult guinea pig ventricular myocytes driven at a constant frequency of 1 Hz under current clamp mode

心肌細胞的動作電位時程和形態取決于各種去極化內向電流和復極化外向電流之間的精細平衡。為說明上述發育過程中鉀電流變化對APD的影響，本實驗采用打孔膜片鉗記錄方式記錄了不同發育階段豚鼠心室細胞的動作電位。打孔膜片可以盡可能保持細胞內容物，使記錄更接近于生理狀態。結果表明，從出生到成年豚鼠心室肌細胞動作電位幅值和靜息膜電位并沒有明顯的改變，而動作電位時程(APD90)隨動物的發育過程逐漸延長。這與先前Agata用玻璃微電極技術記錄到的結果一致［11］。盡管在其他動物發育中IK1逐漸增長［6－8］，確有人發現新生和成年豚鼠心室細胞IK1的電流密度沒有明顯差別［5］，這與本實驗觀察到的靜息電位無明顯變化相一致。此外，在對清醒豚鼠心電圖的研究中也發現，成年組動物的QT和RR間期較幼年組明顯延長［12］。由于豚鼠心肌細胞缺乏Ito，因此影響豚鼠心室肌細胞復極化的鉀電流主要是延遲整流鉀電流。顯然這種動作電位時程的延長是一種與外向鉀電流平衡的內向電流逐漸增強所造成。確有報道，成年豚鼠心室肌細胞中L-型鈣電流的電流密度明顯高于幼年豚鼠［5］，提示豚鼠心室發育過程中APD的逐漸延長主要因L-型鈣電流的增加所致。

目前，豚鼠心臟是研究IKr和IKs的常用動物，特別是近年在藥物影響心臟復極潛在致心律失常風險評價中［13］，上述關于IKr、IKs以及動作電位隨發育改變的實驗結果將為研究豚鼠電生理提供重要背景資料。

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