瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)心力衰竭大鼠心肌的保護(hù)作用

王 斌，張 野，朱海娟，黃春霞，謝春林，吳運(yùn)香，胡憲文，陳志武

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽合肥 230601;2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

慢性心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。合并慢性心力衰竭的心臟手術(shù)患者常會(huì)有心肌缺血/再灌注損傷，其防治措施有待完善。缺血預(yù)處理對(duì)于心力衰竭的心臟是否有保護(hù)作用尚不清楚，而且需中斷器官供血，有駁于醫(yī)學(xué)倫理學(xué)，臨床實(shí)用性不強(qiáng)。瑞芬太尼(remifentanyl，REM)是臨床麻醉中常用的阿片類(lèi)藥物。研究表明［1－3］，瑞芬太尼預(yù)處理可以減輕正常大鼠心肌缺血/再灌注損傷，而對(duì)慢性心力衰竭心臟缺血/再灌注是何影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察不同劑量瑞芬太尼預(yù)處理及缺血預(yù)處理對(duì)離體心衰大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年♂SD大鼠(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量(250±20)g，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(皖)2005-001。

1.2藥品試劑及儀器鹽酸阿霉素(adriamycin，ADR)，批號(hào):9QL0161(意大利 Prizer Italia S.r.l公司);鹽酸瑞芬太尼，批號(hào):1110206(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司公司);氯化三苯基四氮唑(TTC，美國(guó)Sigma公司);兔抗磷酸化Akt(Ser473);LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所)。Langendorff離體心臟灌流裝置(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);powerlab測(cè)壓系統(tǒng)(澳大利亞AD公司)。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型制備參照文獻(xiàn)方法［4－6］，SD 大鼠尾靜脈注射阿霉素，2 μg·g－1，共6周，累計(jì) 12 μg·g－1，制成阿霉素心衰模型。6周末大鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛3 μl·g－1、肝素1 U·g－1抗凝后開(kāi)胸取出心臟，置Langendorff灌注架，逆行灌注，灌注壓力為9.8 kPa，灌注液為K-H液(118.5 NaCl，4.7 KCl，1.2 MgSO4，1.2 KH2PO4，2.5 CaCl2，25.0 NaHCO3，11.0 Glucose，單位 mmol·L－1)。用體積分?jǐn)?shù)為0.95的O2和0.05的CO2混合氣平衡，pH 7.4，溫度37℃，收集冠脈流出液。肺動(dòng)脈圓錐處切開(kāi)，以利于冠脈回流。于左心耳處剪一小口，通過(guò)該小口向左心室內(nèi)置入充有蒸餾水的乳膠水囊導(dǎo)管，接壓力換能器，連接Power Lab系統(tǒng)。改變水囊容積調(diào)節(jié)左心室舒張末壓(LVEDP)為0.266～1.33 kPa。用3-0絲線在左冠狀動(dòng)脈前降支起始部縫一個(gè)線結(jié)，通過(guò)收集線結(jié)實(shí)現(xiàn)區(qū)域心肌缺血，缺血時(shí)表現(xiàn)為:心臟表面局部發(fā)紺、冠脈流量下降及LVDP減小。松開(kāi)線結(jié)以完成心肌再灌注。全部操作完成后，心臟穩(wěn)定15min，有明顯心律失常的心臟棄之不用。

1.3.2分組隨機(jī)將阿霉素心衰心臟分為6組:Sham組、CON 組、IPC組、RPC 1組、RPC 2組、RPC 3組。RPC 1、2、3組分別在缺血前給予濃度為10、30、60 μg·L－1的瑞芬太尼 5 min 后改用不含瑞芬太尼的K-H液5 min，共3個(gè)循環(huán)。除Sham組為持續(xù)灌注165 min外，所有心臟予以30 min缺血，90 min再灌注(Fig 1)。

1.3.3血流動(dòng)力學(xué)記錄基礎(chǔ)值、再灌注5、30、90 min時(shí)心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)、±dp/dtmax、冠脈流量(CF)。

1.3.4乳酸脫氫酶(LDH)分別收集基礎(chǔ)值、再灌注5、30、90 min的冠脈流出液。用試劑盒酶法測(cè)定LDH的活性。

1.3.5心肌梗死面積實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將線結(jié)再次收緊，從主動(dòng)脈內(nèi)注入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%EvenBlue。剔除非心室組織，將心肌置于－80℃冰箱中保存。將速凍后的心臟從心尖到心基部平行切5～6片，2 mm厚的心肌片，置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的TTC溶液中，在37℃(pH 7.4)溫孵15 min染色后置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%福爾馬林固定，缺血危險(xiǎn)區(qū)(AAR)為紅色，梗死區(qū)(IS)為白色。采用Image J圖像分析軟件測(cè)定左心室(LV)、右心室(RV)、AAR、IS的面積，面積乘以0.2cm即為各自體積。計(jì)算(LV+RV)、AAR/(LV+RV)、IS/AAR比值，以IS/AAR反映心肌梗死面積。

Fig 1 Experiment protocol

1.3.6心肌p-Akt表達(dá)水平采用Western blot法檢測(cè)。再灌注90 min后取左心室心肌組織，迅速液氮冷凍保存，標(biāo)本取齊后，剪碎心肌，加組織裂解液，冰上勻漿，4℃ 10 000×g離心5 min，取上清，BCA法測(cè)蛋白，配平，按照每 4 μl蛋白樣品加入 1 μl SDS-PAGE凝膠上電泳，電轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗(p-Akt，1 ∶500稀釋;總 Akt 1 ∶500稀釋)，4 ℃水平搖床孵育過(guò)夜，TBST沖洗，加入二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，1∶10 000稀釋)，室溫振蕩孵育2 h，TBST沖洗，化學(xué)發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍攝。采用Image-pro plus 6.0版圖像分析軟件分析，以p-Akt與總Akt灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用配對(duì)設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1血流動(dòng)力學(xué)各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)基礎(chǔ)值差異無(wú)顯著性。與Sham組相比，其余各組在再灌5、30、90 min時(shí)的 LVDP、±dp/dtmax、CF 降低(P＜0.05)。與 I/R 組相比，再灌5、30、90 min時(shí)，RPC 2組和RPC 3組的 LVDP、±dp/dtmax、CF較高(P＜0.05)，并呈劑量依賴性。而IPC組和RPC1組的各項(xiàng)指標(biāo)較I/R組差異無(wú)顯著性。

2.2LDH活性LDH各組LDH基礎(chǔ)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與Sham組相比，其余各組在再灌5、30、90 min的LDH活性升高(P＜0.05)。與I/R組相比，RPC 2和RPC 3組在再灌5、30、90 min時(shí)的LDH活性降低(P＜0.05)。而IPC和RPC 1組的LDH的活性較I/R組無(wú)差異(Fig 2)。

Fig 2 Effect of remfentanil interventions on LDH release in coronary effluent in isolated perfused rat heart subjected to 30 min regional ischemia followed by 90 min reperfusion(±s，n=10)

2.3心肌梗死面積各組(LV+RV)、ARR、AAR/(LV+RV)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與Sham組相比，其余各組梗死面積升高(P＜0.05)。與I/R組相比，RPC 2和RPC 3組的梗死面積較小(P＜0.05)。而IPC和RPC 1組的梗死面積較I/R組差異無(wú)顯著性(Fig 3)。

2.4p-Akt的表達(dá)p-Akt各組總Akt表達(dá)水平無(wú)差異(P＞0.05)。與 Sham組相比，其余各組p-Akt蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.05)。與I/R組相比，RPC 2和RPC 3組p-Akt蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.05)，而IPC和RPC1組p-Akt蛋白表達(dá)水平較I/R組差異無(wú)顯著性(Fig 4)。

3 討論

瑞芬太尼作為新的阿片類(lèi)受體激動(dòng)劑，其藥效強(qiáng)、起效迅速、副作用小、劑量容易控制、安全可靠。瑞芬太尼對(duì)μ阿片受體有強(qiáng)親和力，也作用于δ、κ受體。新近的研究［1－3］結(jié)果表明瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)正常大鼠心臟的缺血/再灌注損傷可產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

Fig 3 Effect of remfentanil interventions on infarct size，as a percentage of the area at risk(IS/AAR)in isolated perfused rat heart subjected to 30 min regional ischemia followed by 90 min reperfusion(±s，n=6)

Fig 4 Western blot analysis of phosphor-Akt and total Akt at the 90 min of reperfusion(±s，n=4)

Tab 1 Hemodynamic parameters of each group(±s，n=10)

Tab 1 Hemodynamic parameters of each group(±s，n=10)

*P＜0.05 vs sham group，#P＜0.05 vs I/R group

Variable Group Basline Reperfusion 5 min Repe rfusion 30 min Reperfusion 90 min HR/beat·min －1Sham 252±28 242±25 238±30 229±25 I/R 248±36 234±33 225±27 228±26 IPC 256±18 230±36 229±30 222±23 RPC 10 μg·L－1 236±30 229±23 229±22 226±23 RPC 30 μg·L－1 242±37 231±40 226±35 214±34 RPC 60 μg·L－1 241±23 232±32 229±21 227±21 LVDP/kPa Sham 12.7 ±2.0 12.0 ±1.8 11.8 ±1.3 11.8 ±1.5 I/R 13.1 ±1.3 7.2 ±1.0* 6.6 ±1.1* 5.8 ±0.6*IPC 12.8 ±1.6 6.4 ±1.5* 6.4 ±0.9* 5.4 ±1.0*RPC 10 μg·L －1 12.6 ±1.9 6.7 ±1.6* 6.2 ±1.5* 5.6 ±1.6*RPC 30 μg·L －1 12.5 ±1.7 8.7 ±1.0*# 8.3 ±1.3*# 7.7 ±1.1*#RPC 60 μg·L －1 12.3 ±1.9 10.1 ±1.5*# 9.7 ±1.8*# 9.2 ±1.1*#+dp/dtmax/kPa·s－1 Sham 376±69 365±66 356±59 350±59 I/R 375±58 174±36* 156±45* 147±24*IPC 368±27 164±28* 157±25* 135±35*RPC 10 μg·L－1 344±36 172 ±44* 168±41* 157 ±51*RPC 30 μg·L－1 376±59 221±39*# 220±30*# 185±45*#RPC 60 μg·L－1 344±51 288±36*# 281±66*# 261±59*#－dp/dtmax/kPa·s－1 Sham 244±46 192±57 190±23 185±27 I/R 238±52 98±17* 94±22* 83±12*IPC 222±25 87±19* 86±17* 75±19*RPC 10 μg·L－1 221±27 89±25* 82±27* 76±26*RPC 30 μg·L－1 226±35 129±19*# 124±32*# 102±16*#RPC 60 μg·L－1 219±38 162±37*# 155±44*# 136±15*#CF/ml·min －1 Sham 20.4 ±2.1 17.0 ±1.3 16.0 ±1.2 15.2 ±1.3 I/R 20.2 ±2.3 9.6 ±1.8* 8.9 ±2.2* 8.0 ±1.8*IPC 19.6 ±3.2 10.8 ±1.6* 9.5 ±1.6* 9.0 ±1.5*RPC 10 μg·L －1 20.3 ±3.3 10.9 ±1.8* 9.4 ±2.1* 8.9 ±2.9*RPC 30 μg·L －1 22.1 ±3.6 13.7 ±2.5*# 12.8 ±2.4*# 11.7 ±2.4*#RPC 60 μg·L －1 19.2 ±2.7 15.1 ±1.7*# 14.7 ±1.8*# 12.9 ±1.6*#

1986年Murry首次描述缺血預(yù)處理即心肌在幾次短暫的缺血后可以減輕隨后較長(zhǎng)時(shí)間的缺血后損傷［7］。而本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在阿霉素充血性心力衰竭大鼠缺血/再灌注模型中，缺血預(yù)處理的保護(hù)作用消失了。

近年來(lái)，研究［8－9］發(fā)現(xiàn)一些麻醉藥物預(yù)處理(APC)能減輕心肌缺血/再灌注損傷。其機(jī)制是通過(guò)多種信號(hào)通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用。其中，磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)通路在經(jīng)過(guò)各種處理后予以激活，并發(fā)揮心肌保護(hù)作用［10］。PI3K-Akt介導(dǎo)的信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化、凋亡等活動(dòng)。大量研究證實(shí)［11－12］，Akt磷酸化的變化與心肌保護(hù)效應(yīng)的變化有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)選用的是較成熟的Langendorff離體灌注模型，排除了神經(jīng)、內(nèi)分泌等多種因素的影響，從而觀察藥物對(duì)心臟的直接作用。HR、LVDP、±dp/dtmax、CF是離體灌注模型中反映心臟功能的有效指標(biāo)。心肌梗死面積是反映心肌損傷的金標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)急性心肌梗死時(shí)，冠狀動(dòng)脈血供急劇減少或中斷，使相應(yīng)的心肌嚴(yán)重而持久的急性缺血導(dǎo)致心肌壞死，促使大量的心肌酶如LDH等自壞死細(xì)胞釋放，血液中相應(yīng)的酶含量明顯升高。在本實(shí)驗(yàn)中，單純?nèi)毖?再灌注組心功能指標(biāo)較Sham組明顯下降，說(shuō)明缺血/再灌注模型制造成功。

阿霉素是臨床上常用的抗腫瘤藥物，因其與心臟受體的高親和力而使其心臟毒性明顯［13－14］，單次或多次注射可致阿霉素心肌病，進(jìn)一步發(fā)展為心力衰竭。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在阿霉素心衰大鼠離體心肌缺血/再灌注模型，適量的瑞芬太尼預(yù)處理可以減輕心肌的收縮和舒張功能障礙、減輕心肌梗死面積、降低LDH活性。用Western blot半定量分析p-Akt，顯示瑞芬太尼預(yù)處理后使得p-Akt表達(dá)量增加，說(shuō)明瑞芬太尼預(yù)處理與p-Akt的變化有一定的相關(guān)性。

綜上所述，瑞芬太尼預(yù)處理可能通過(guò)增強(qiáng)Akt的磷酸化來(lái)減輕阿霉素心力衰竭大鼠的心肌缺血/再灌注損傷。

［1］Zhang Y，Michael G，Irwin M B，et al.Remifentanil preconditioning confers cardioprotection via cardiac κ and σ opioid receptors［J］.Anesthesiology，2005，102:371 －8.

［2］Kim H S，Chos J E，Hong S W，et al.Remifentanil protects myocardium through activation of anti-apoptotic pathways of survival in ischemia-reperfused rat heart［J］.Physiol Res，2010，59:347 －56.

［3］張 野，顧爾偉，張 健，陳志武.瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)離體大鼠缺血后心臟的保護(hù)作用［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40(4):324－6.

［3］Zhang Y，Gu E W，Zhang J，Chen Z W.Cardioprotective effects of remifentanil preconditioning on isolated rat heart suffering from ischemia and reperfusion［J］.Acta Univ Med Anhui，2005，40(4):324－6.

［4］吳運(yùn)香，張 野，謝春林，等.SD大鼠阿霉素慢性心力衰竭模型的建立與評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(8):1170－3.

［4］Wu Y X，Zhang Y，Xie C L，et al.Establishment and evaluation of adriamycin-induced chronic heart failure model in SD rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(8):1170 －3.

［5］Sutherland F J，Shattock M J，Bakeret K E，et al.Mouse isolated perfused heart:Characteristics and cautions［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2003，30:867 －78.

［6］Monika S S，Bartosz G，Adam S ，et al.Isolated heart perfusion according to Langendorff——Still viable in the new millennium［J］.Pharmacol Toxicol Meth，2007，55:113 －26.

［7］Gross G J.Role of opioids in acute and delayed precondioning［J］.J Mol Cell Cardiol，2003，35(7):709 －18.

［8］Lewis M C，Terriet M，Delacruz L，et al.Rapid sevoflurane induction compared with thiopental［J］.J Clin Anesth，2004，16(4):271－5.

［9］Schultz J E，Hsu A K，Gross G J.Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart［J］.Circ Res，1996，78(6):1100－4.

［10］Aoyagi T，Matsui T .Phosphoinositide-3 kinase signaling in cardiac hypertrophy and heart failure［J］.Curr Pharm Des，2011，17:1818－24.

［11］Raphael J，Abedat S，Rivo J，et al.Volatile anesthetic preconditioning attenuates myocardial apoptosis in rabbits after regional ischemia and reperfusion via Akt signaling and modulation of Bcl-2 family proteins［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，318(1):186 －94.

［12］Hausenloy D J，Yellon D M.Reperfusion injury salvage kinase signalling:taking a RISK for cardioprotection［J］.Heart Fail Rev，2007，12(3-4):217－34.

［13］Singal P K，Deally C M，Weinberg L E.Subcellular effects of adriamycin in the heart:a concise review［J］.J Mol Cell Cardiol，1987，19(8):817－28.

［14］Lu L H，Wu W K，Yan J Y，et al.Adriamycin-induced autophagic cardiomyocyte death plays a pathogenic role in a rat model of heart failure［J］.Int J Cardiol，2009，134(1):82 －90.