大黃酚脂質體對阿爾采末病模型小鼠學習記憶的改善作用

朱成琳，張丹參，宋金艷，宋志斌，薛貴平

(河北北方學院藥理學教研室，河北張家口 075000)

大黃酚(chrysophanol，Chry)為中藥大黃的有效成分之一，近期研究表明，大黃酚具有明顯的抗衰老作用［1］，并且還有抗大鼠肝、腦過氧化脂質生成的作用［2－3］。近期有研究者結合現代藥劑新技術，制備出大黃酚納米囊、微囊、包合物和脂質體等多種制劑，其中大黃酚脂質體的脂溶性較好，有腦部靶向性，對神經性損傷療效最佳［4］。阿爾采末病(AD)是一種比較常見的神經系統退行性疾病，記憶減退和認知功能障礙是其主要的臨床特征，大黃酚脂質體能否改善AD患者的學習記憶障礙，尚未見報道。本研究采用1次性直接側腦室注射(icv)凝聚態β-淀粉樣肽(Aβ25-35)的方法建立 AD 小鼠模型［5］，選擇大黃酚脂質體制劑對AD模型小鼠學習記憶的影響進行觀察并探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物♂昆明種小鼠，體質量25～28 g，由中國醫學科學院藥物研究所提供(許可證編號:SCXK京2004-0001)。

1.2儀器LabTech UV9100全自動紫外可見分光光度計(LabTech公司);SIGMA 3K30高速冷凍離心機(德國);Forma－86℃超低溫冰箱(Thermo elecerom);ME235P型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);FSH-2型可調高速勻漿器(江蘇大地自動化儀器廠);微量進樣器(寧波市鎮海玻璃儀器廠);STT-2跳臺儀(中國醫學科學院藥物研究所);Y型水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所);HH-1型數顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇精達儀器廠);SZ-97自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3藥品與試劑大黃酚標準品(中國生物制品檢定所提供，批號110796-201017);大黃酚對照品(質量分數≥98%，陜西寶雞國康生物藥品有限公司，批號 GKSW20100814);β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide， Aβ25-35)(美 國 Sigma 公 司，批 號108K4794);N，N-二甲基甲酰胺、吐溫-80、膽固醇、卵磷脂、鄰苯三酚、鉬酸銨、聚乙二醇2000、維生素E、無水乙醇等試劑均為分析純;實驗用水為三重蒸餾水。

1.4藥品的制備制備大黃酚N，N-二甲基甲酰胺單體［大黃酚對照品用生理鹽水:N，N-二甲基甲酰胺(DMF)∶吐溫-80=8∶1∶1溶解］溶液［3］，薄膜蒸發法制備大黃酚脂質體［6］溶液，將這兩種劑型均稀釋成1 ×10－3mg·L－1備用。

1.5分組及給藥取健康♂昆明種小鼠70只，體質量25 g～28 g，適應性飼養1周，按體質量均衡原則隨機分為7組(n=10)，即正常對照組、Aβ25-35致AD模型組、大黃酚脂質體溶劑對照組、大黃酚單體組(10 mg·kg-1)、大黃酚脂質體高、中、低劑量組(10、1、0.1 mg·kg－1)［4］。

1.6建立Aβ25-35致AD模型方法Aβ25-35，用滅菌蒸餾水溶解，濃度1.0 mmol·L－1，密封后置37℃培養箱中孵育72 h，使其成凝聚狀態，－20℃儲存備用。將小鼠用3.5%水合氯醛(10 mg·kg－1)腹腔注射麻醉后，用手抓住小鼠頭部皮膚并將皮膚拉緊，在距頭部中線2 mm處與兩側耳根前部連線相交叉的點，用10 μl微量進樣器垂直刺入3.0 mm，穿破顱骨，進入腦室，模型組、溶劑組、單體組、脂質體組緩慢注入Aβ25-35溶液3 μl，正常對照組緩慢注入3 μl生理鹽水，并停留 5 min［5］。

1.7給藥方法AD模型建立后，正常對照組和模型組立即尾靜脈注射生理鹽水，其余各組給予相應的溶劑和藥物，10 mg·kg－1，每天1次，連續給藥8 d。

1.8Y型水迷宮對實驗動物學習記憶功能的測試d 3采用Y型水迷宮實驗監測小鼠學習記憶功能。記錄小鼠平均逃避潛伏期(從入水起點至尋找到階梯出水的時間)和正確反應次數(以10 s內直接抵達平臺為正確反應)［7］。預訓練1 d，每天10次，每次訓練時間定為3 min，3 min仍未找到安全通道者以180 s計算。正式測試2 d，每天10次，每次測試時間定為3 min，3 min仍未找到安全通道者以180 s計算。

1.9采用跳臺實驗對實驗動物學習記憶功能的測試給藥后6 d采用跳臺實驗訓練小鼠學習記憶功能。跳臺裝置為一被動回避反射箱，箱底鋪以銅柵作為刺激電極，箱內均分為5個小格，右后角放置一個的橡膠質平臺作為回避電擊安全區。實驗時將5只小鼠分別放入反射箱的5個小格內適應3 min，然后通入36 V交流電，小鼠受電擊，正常反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激。多數小鼠可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺。以小鼠兩前足同時接觸銅柵遭到電擊為錯誤反應，觀察并記錄5 min內錯誤反應次數［8］。24 h后測驗，以觀察其記憶保持情況，測試時記錄小鼠在第1次跳下平臺的潛伏期及5 min內的錯誤反應次數。以7 d和8 d的實驗數據為正式測試數據。

1.10小鼠耐缺氧實驗方法學習記憶實驗結束后，將小鼠禁食12 h，自由飲水，用大剪刀于小鼠耳根后部快速斷頭，同時紀錄小鼠張口次數和張口呼吸時間，測定小鼠斷頭耐缺氧生存時間，以5 s不再張口呼吸為觀察指標不再計時［1］。

1.11比色法測定小鼠腦組織SOD、CAT酶活性學習記憶實驗結束后，將小鼠禁食12 h，自由飲水，用大剪刀于小鼠耳根后部快速斷頭處死，迅速于冰盒上取其全腦(去小腦)，4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，精密稱重，用4℃滅菌生理鹽水制成10%腦勻漿，3 000 r·min離心15 min，取上清液，采用鄰苯三酚自氧化法測定小鼠腦組織中SOD活性［9］，鉬酸銨顯色法測CAT活性［10］。

1.12數據處理數據資料采用Excel軟件分析，用±s表示，并用SPSS17.0統計軟件，運用t檢驗進行比較。

2 結果

2.1大黃酚脂質體對Aβ25-35致AD模型小鼠Y迷宮實驗的影響結果表明:Aβ25-35模型組與空白對照組比較，模型組小鼠的逃避潛伏期明顯延長(P＜0.01)，正確反應次數明顯減少(P＜0.01);大黃酚脂質體高、中劑量組和單體組與溶劑對照組相比，潛伏期明顯縮短(P＜0.05～P＜0.01)，正確反應次數明顯增加(P＜0.05～P＜0.01)，大黃酚脂質體低劑量組對上述各項指標無改善作用(P＞0.05)，說明大黃酚脂質體的上述藥理作用有劑量依賴性;大黃酚脂質體高劑量組與等濃度的大黃酚單體組也有明顯差異(P＜0.05)。說明大黃酚脂質體上述藥理作用要優于大黃酚單體溶液。見Tab 1。

2.2大黃酚脂質體對Aβ25-35致AD模型小鼠跳臺實驗的影響結果表明:Aβ25-35模型組與空白對照組比較，模型組小鼠的潛伏期明顯縮短(P＜0.01)，錯誤反應次數明顯增加(P＜0.01);大黃酚脂質體高、中劑量組、大黃酚單體組與溶劑對照組相比，潛伏期明顯延長(P＜0.05～P＜0.01)，錯誤反應次數明顯減少(P＜0.05～P＜0.01)，大黃酚脂質體低劑量組對上述各項指標無改善作用(P＞0.05)，說明大黃酚脂質體的上述藥理作用有劑量依賴性;大黃酚脂質體高劑量組與等濃度的大黃酚單體組也有明顯差異(P＜0.05～P＜0.01)，說明大黃酚脂質體上述藥理作用要優于大黃酚單體溶液。見Tab 1。

2.3大黃酚脂質體對Aβ25-35致AD模型小鼠斷頭耐缺氧生存時間的影響結果表明:Aβ25-35模型組與空白對照組比較，模型組小鼠斷頭耐缺氧生存時間和張口呼吸次數均明顯縮短(P＜0.01);大黃酚脂質體高、中劑量組、大黃酚單體組與溶劑對照組相比，小鼠斷頭耐缺氧生存時間和張口呼吸次數均明顯增加(P＜0.05～P＜0.01)，大黃酚低劑量組對上述各項指標無改善作用(P＞0.05)，說明大黃酚脂質體的上述藥理作用有劑量依賴性;大黃酚脂質體高劑量組與等濃度的大黃酚單體組也有明顯差異(P＜0.05)，說明大黃酚脂質體上述藥理作用要優于大黃酚單體溶液。見Tab 2。

Tab 1 Effects of chrysophanol liposomes on AD model mice in Y-maze and step-down test(±s，n=10)

Tab 1 Effects of chrysophanol liposomes on AD model mice in Y-maze and step-down test(±s，n=10)

△△P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs liposomes solvent;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs chry

Group Dose/mg·kg－1 Y-maze test Step-down test Latent period/s No.of cor.Latent period/s No.of err.Control 4.30 ±1.76 6.7 ±2.3 210 ±43 0.7 ±0.5 Model 8.76 ±1.32△△ 3.4 ±1.7△△ 94 ±29△△ 2.9 ±0.9△△Liposomes solvent 8.21 ±1.54 4.1 ±1.1 101 ±26 2.5 ±1.1 Chry 10 5.27 ±2.12## 5.6 ±2.0## 143 ±51## 1.4 ±1.0##Chry liposomes 10 4.96 ±1.29##* 5.9 ±1.1##* 162 ±36##＊＊ 1.2 ±0.7##*Chry liposomes 1 6.69 ±1.44# 5.5 ±1.3# 121 ±22# 1.9 ±0.5#Chry liposomes 0.1 7.62 ±1.65 4.8 ±1.6 98 ±17 2.5 ±0.6

Tab 2 Effects of chrysophanol liposomes on AD mice SOD and CAT activities in brain and breakage anoxia tolerance test(±s，n=10)

Tab 2 Effects of chrysophanol liposomes on AD mice SOD and CAT activities in brain and breakage anoxia tolerance test(±s，n=10)

△P＜0.05，△△P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs liposomes solvent;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs chry

Group Dose/mg·kg－1 No.mouth Survival time/s SOD/kU·g－1 CAT/kU·g －1 Control 11.2 ±3.1 14.39 ±4.10 693 ±12.6 14.8 ±3.6 Model 6.6 ±2.9△△ 7.78 ±3.12△△ 408 ±42.2△△ 7.3 ±3.2△△Liposomes solvent 7.4 ±1.9 9.89 ±2.38 416 ±26.7 8.7 ±2.0 Chry 10 9.5 ±3.2## 13.05 ±2.25## 551 ±44.9## 13.1 ±2.8##Chry liposomes 10 10.2 ±2.1##* 13.60 ±2.92##* 569 ±31.6##＊＊ 13.9 ±1.5##*Chry liposomes 1 8.9 ±2.7# 11.04 ±2.67# 470 ±27.6# 11.6 ±2.1#Chry liposomes 0.1 7.2 ±1.4 10.66 ±2.54 424 ±18.4 10.2 ±2.6

2.4大黃酚脂質體對Aβ25-35致AD模型小鼠腦組織中SOD與CAT酶活性的影響結果表明:Aβ25-35模型組與空白對照組比較，模型組小鼠腦組織中SOD與CAT酶活性均明顯降低(P＜0.01);大黃酚脂質體高、中劑量組、大黃酚單體組與溶劑對照組相比，小鼠腦組織中SOD與CAT活性均明顯升高(P＜0.05～P＜0.01)，大黃酚低劑量組對上述各項指標無明顯改善作用(P＞0.05)，說明大黃酚脂質體的上述藥理作用有劑量依賴性;大黃酚脂質體高劑量組與等濃度的大黃酚單體組差異有顯著性(P＜0.05～P＜0.01)，說明大黃酚脂質體上述藥理作用要優于大黃酚單體溶液。見Tab 2。

3 討論

阿爾采末病是一種進行性中樞神經系統退行綜合征，主要表現為記憶、認知、語言和行為障礙及人格改變等，其中以學習記憶下降為主要癥狀，嚴重影響中老年人的生活質量［11］，隨著全球人口老齡化趨勢日益明顯，AD作為老年性癡呆中最常見的一種類型，已成為一個重要的社會問題，因此積極探討癡呆性疾病的藥物治療和預防具有重大醫學價值和社會意義。以往研究表明，大黃酚單體具有明顯的抗神經性損傷作用，而本實驗選擇大黃酚脂質體制劑，采用尾靜脈注射方式，發現脂質體制劑比單體溶液有更好的改善AD模型小鼠學習記憶的能力，并能提高腦組織中SOD與CAT的活性，提示大黃酚改善Aβ25-35致AD模型小鼠學習記憶能力的機制，可能是通過提高抗氧化酶活性，減少氧化應激介導的Aβ25-35的神經毒性，同時防止自由基組織對細胞的氧化損傷，保護神經細胞免受過氧化脂質的破壞，改善細胞功能和能量代謝障礙而實現的。本實驗給藥方式采用尾靜脈注射方式，相比以往的腹腔注射、口服灌注等其他給藥方式，能減少吸收過程帶來的藥物損失，而且靜脈給藥方式作用迅速，為大黃酚早日進入臨床實驗提供必要的實驗支持。本實驗還發現小劑量的大黃酚脂質體對改善小鼠學習記憶和酶活性的影響不明顯(Chry 0.1 mg·kg－1，P＞0.05)，提示大黃酚脂質體的作用有劑量依賴性。

大黃酚脂質體具有明顯的抗缺氧和提高小鼠耐力、抗疲勞的能力，可能與其擴血管作用有關［12］，本實驗表明，AD模型小鼠斷頭耐缺氧生存時間縮短、張口次數減少，而大黃酚脂質體制劑能明顯提高斷頭耐缺氧時間和張口次數，缺氧對機體是一種劣性刺激，尤其影響機體的供能。大黃酚脂質體在腦缺氧過程中也起到了保護作用，說明大黃酚制劑在Aβ損傷神經細胞的過程中起到了保護作用。

大黃酚難溶于水，口服吸收差且有腸胃刺激，將其制成脂質體制劑后，提高了藥物的穩定性、安全性、有效性和靶向性［13］，對AD模型小鼠記憶功能障礙、老化相關酶和耐缺氧方面有明顯的保護作用，因此，大黃酚脂質體制劑有可能成為治療AD的新型藥物。

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