乳香沒藥對大鼠膽汁分泌的影響*

朱桃桃，王安紅，周 昆，盧國彥，馬志會

2010版藥典首次將乳香、沒藥收錄其中，乳香、沒藥均有活血止痛的功效，常作為對藥使用，但藥典中并未有乳香、沒藥毒性的記載。五味是指藥物因功效不同而具有辛、甘、酸、苦、咸味，五味與歸經、毒性有關系，五味是產生毒性的物質基礎，藥物的毒性主要來自辛、苦味；五味歸經具有普遍性，其中以歸肝經者為多，苦、咸味主歸肝經，辛味主歸肺、脾、肝經[1]。乳香，辛、苦，溫，歸心、肝、脾經；沒藥，辛、苦，溫，歸心、肝、脾經[2-3]。本組實驗人員在研究中也發現乳香、沒藥對Beagle犬及大鼠有較明顯的肝臟毒性，肝內可見輕度膽汁淤積[4-5]。筆者觀察了乳香、沒藥對大鼠膽汁分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 受試藥 乳香、沒藥（購自天津市順時德大藥房），粉碎后以生藥粉給藥。

1.2 動物 Wistar大鼠 [購自天津市山川紅實驗動物科技有限公司，合格證號：SCXK（津）2009－0001]，所用飼料為全價顆粒飼料（天津市華榮實驗動物科技有限公司生產），飼養于天津中醫藥大學實驗動物中心。

1.3 試劑和儀器 總膽汁酸（TBA）試劑盒（中生北控生物科技有限公司），谷胱甘肽（GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所），JJ2000精密電子天平（常熟雙杰測試儀器廠），AE200S電子分析天平（上海梅特勒－托利多儀器有限公司），Micro95半自動生化儀（荷蘭威圖科學公司），Agilent 1100 HPLC系統（美國Agilent公司），DYY—IIIB電泳儀（北京六一儀器廠），轉膜裝置（Bio－Rad，美國），ENEGENIUS凝膠成像系統（Bio Imaging System，Syngene，英國）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及樣本采集 Wistar大鼠48只，雌雄各半，體質量180～220 g，采用隨機數字表法隨機分為4組，分別為對照組9只、乳香組12只、沒藥組11只、乳香沒藥組10只，各給藥組劑量均為生藥3 g/kg，按10 mL/kg體質量灌胃給藥，每日1次，連續灌胃給藥2周，對照組給予等體積的自來水。末次給藥后麻醉動物，腹中線開2 cm切口，在十二指腸腸系膜處分出膽管，在距十二指腸2 cm的膽管處切口插入塑料軟管，收集給藥后0.5～1.5 h內的膽汁。膽汁收集完后取肝臟，將收集標本置于-70℃超低溫冰箱凍存。

1.4.2 TBA和GSH檢測 將收集的膽汁用半自動生化儀分別測試TBA、GSH含量，其中測膽汁TBA時將膽汁稀釋100倍。TBA采用酶循環法，GSH采用比色定量測定法。

1.4.3 肝臟膽鹽輸出泵（BSEP）和法尼醇X受體（FXR）檢測 提取肝組織蛋白，蛋白樣品置于SDS變性聚丙烯酞胺凝膠上電泳，將分離的蛋白條通過轉移電泳方式轉印至PVDF膜上。分別用非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育、檢測。電泳條件為80 V，30 min；濕轉條件為65 V轉膜2 h。一抗稀釋比例（1∶1 000），二抗稀釋比例（1∶3 000）。

1.4.4 高效液相色譜（HPLC）法檢測 將收集的膽汁用乙酸乙酯萃取渦旋2 min，5 000 r/min離心10 min，取有機層氮氣吹干，用甲醇復溶進樣。乳香、沒藥生藥粉同膽汁相同方法處理進行HPLC檢測。

色譜條件：色譜柱AgilentTC-C18（4.6mm×150mm，5.0 μm）。流動相為乙腈∶水＝65∶35；流速 1.0 mL/min；柱溫30℃；紫外檢測波長245 nm。進樣量20 μL。

1.5 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件處理，計量資料采用均數±標準差（s）表示，正態分布計量資料的組間比較采用單因素方差分析，偏態分布計量資料的組間比較采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳香、沒藥對大鼠膽汁流量及膽汁中TBA、GSH的影響 乳香、沒藥和乳香沒藥組大鼠膽汁流量均明顯高于對照組（P＜0.05），見表1。膽汁中TBA濃度各給藥組均顯著低于對照組（P＜0.01），乳香組明顯低于沒藥組（P＜0.01）；GSH 濃度各給藥組均低于對照組（P＜0.05），乳香、乳香沒藥組明顯低于沒藥（P＜0.01）。通過膽汁分泌的TBA量乳香、乳香沒藥組顯著低于對照組（P＜0.05），乳香組明顯低于沒藥組（P＜0.05）；而通過膽汁分泌的 GSH 量各組之間差異無統計學意義，見表2。

2.2 BSEP、FXR蛋白的表達 與對照組相比，各給藥組BSEP蛋白的表達差異無統計學意義，FXR有上升的趨勢，見圖1。

表1 乳香、沒藥對大鼠膽汁流量的影響（s）

表1 乳香、沒藥對大鼠膽汁流量的影響（s）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別 n 膽汁量（mL）對照組 9 0.91±0.20乳香組 12 1.65±0.43**沒藥組 11 1.33±0.26*乳香沒藥組 10 1.50±0.68**

表2 乳香、沒藥對大鼠TBA、GSH的影響（s）

表2 乳香、沒藥對大鼠TBA、GSH的影響（s）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與沒藥組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

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圖1 BSEP、FXR蛋白的表達

2.3 HPLC分析 由膽汁及生藥液相色譜可知，乳香、沒藥均有多種成分進入膽汁，在此色譜條件下主要集中在2～5 min，見圖2。

3 討論

實驗表明，連續給予乳香、沒藥2周能增加大鼠膽汁流量，但排入膽管的TBA量減少，且乳香對膽汁流量及TBA分泌量的影響強于沒藥。肝細胞通過膽汁分泌的TBA量減少會導致TBA在肝細胞內過度蓄積，這可能是乳香、沒藥導致肝損傷的一個原因。

圖2 膽汁及生藥的HPLC圖

肝臟是藥物從體內清除的主要場所，膽汁排泄是許多化合物的代謝及消除途徑。膽汁的形成是由于膽汁酸鹽和其他有機離子通過主動運輸方式進入毛細膽管，造成滲透壓梯度，使水被動排入從而形成膽汁流。膽流主要分為膽鹽依賴性膽流和膽鹽非依賴性膽流兩種，TBA及GSH分別是膽鹽依賴性膽流和膽鹽非依賴性膽流的主要驅動力[5]。BSEP是膽汁酸轉運的主要載體，GSH的主要轉運載體是多藥耐藥相關蛋白2（MRP2）[6-8]，作為膽汁酸的受體FXR可以直接結合在BSEP的啟動子上調控BSEP的表達來維持膽汁酸的內環境穩定。乳香、沒藥均能增加膽汁流量，但膽汁中TBA、GSH濃度均大幅降低，并且乳香、乳香沒藥組通過膽汁分泌的TBA量也顯著減少，而通過膽汁分泌的GSH量無明顯變化，提示MRP2蛋白的表達沒有受到影響，而BSEP的表達可能受到了抑制。但是接下來的BSEP蛋白表達結果顯示，BSEP的表達并沒有受到抑制。TBA、GSH是膽汁流的主要驅動力，其排出量降低時會導致膽汁流量減少，而乳香、沒藥在使膽汁排出的TBA量顯著降低的情況下膽汁流量反而增加了，在排除了BSEP蛋白表達受抑制的前提下，推測乳香、沒藥有成分通過BSEP轉運至膽汁，或可以抑制BSEP的轉運能力。對膽汁及乳香、沒藥生藥萃取物的HPLC分析結果顯示，給藥組膽汁中存在乳香、沒藥的多種成分，證實乳香、沒藥有的成分可通過膽汁分泌。本實驗表明乳香、沒藥排入膽管使膽汁流量增加，對TBA的排出形成競爭性抑制，使TBA濃度降低，但乳香、沒藥轉運的相關載體有哪些還有待于進一步的研究。

[1]周 昆，代 志，柳占彪，等.壯骨關節丸中肝毒性藥材的篩選研究[J].中國藥物警戒，2009，6(11):641.

[2]郭 輝，張 玲.乳香中化學成分和藥理作用的研究進展[J].食品與藥品，2007，9（15）：50-52.

[3]韓淑芬，金仲品.沒藥的藥理活性研究進展[J].時珍國醫國藥，2008，19（6）：1502-1506.

[4]談 英，徐 鑫，周 昆，等.乳香沒藥及其提取物對大鼠肝毒性的實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16(6):221.

[5]張雪瑩,楊 勁，尹雪芬，等.谷胱甘肽的肝臟轉運及其在膽汁淤積中的作用[J].藥學學報，2009，44(4):327.

[6]Nathanson MH,Boger JL.Mechanisms and regulation of bile secretion[J].Hepatology,1991,14(3):551.

[7]張雪瑩，楊 勁，尹雪芬，等.谷胱甘肽的肝臟轉運及其在膽汗淤積中的作用[J].藥學學報，2009，44（4）：327-332.

[8]陸倫根，曾民德.膽汁酸對線粒體的毒性作用[J].肝臟，2008，13（4）：343-346.