蒙藥銀朱體外溶出實驗可溶性汞含量的測定

苗培福 張瑞霞

(2.內蒙古烏海市蒙中醫院，內蒙古 烏海016000)

安全性、有效性和質量可靠性是藥品屬性的三個基本要素，蒙藥也不例外。蒙藥是我國的傳統用藥，攝入汞劑量稍大或長期少量攝入在體內蓄積到一定程度均可引起中毒，損害腎臟、中樞神經系統、消化系統以及泌尿系統〔1〕。近年來，藥汞含量超標問題已引起國內外的關注，為實現蒙藥現代化，并且使蒙藥走向國際市場，就必須強化對蒙藥中可溶性汞含量的測定和分析〔2〕。

銀朱最早載于《本草綱目》，它是人工制成的赤色硫化汞(HgS)，尚含有微量鉛(Pb)、銅(Cu)、鈉(Na)、鐵(Fe)、鋁(Al)等雜質。其味辛，性溫，有毒。具有:攻毒、殺蟲、燥濕、劫痰，等功效。銀朱為許多蒙藥成方所應用，例如清肺十八味丸。

蒙藥使用的黑辰砂非天然產物，是按1:1比例硫磺炮制銀朱(汞)，在鐵鍋內用煤爐加熱至200～300℃左右反復攪拌形成黑灰色為止，其主要成分是硫化汞，它是蒙藥復方制劑常用藥材，具有鎮驚、清熱、收斂、破癰等作用，在44%蒙藥水丸劑中配伍使用〔13〕。

銀朱、黑辰砂中的硫化汞是一種較為穩定的汞鹽，溶度積為9.3×10～53，在水中幾乎不溶，是一種極難溶的化合物，與其它含汞化合物相比，毒性較低〔4－5〕。動物實驗表明，銀朱口服后，其中的汞可經胃腸道吸收，且吸收量遠大于按溶度積計算的理論值。有文獻報道，銀朱中的硫化汞是不被機體吸收的無活性成分(約占給藥量的98%)，而且有活/毒性成分為可溶性汞部分〔6〕。因此本實驗模擬胃腸道實際情況，系統的比較人工胃液、人工腸液中胃蛋白酶、胰蛋白酶及硫化物對汞溶出的影響，用雙硫腙分光光度法測定銀朱、黑辰砂、納米銀朱及蒙藥成方清肺十八味丸在不同化學體系中可溶性汞的含量，初步研究可能被人體吸收的汞的含量，從而為建立銀朱及含銀朱蒙藥的質量控制標準和臨床用藥的安全合理性提供依據〔7－8－9〕。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

RC806溶出試驗儀(天大天發);WFJ7200型可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司);FA214電子天平(上海海康電子儀器廠);DGG－9240B型智能鼓風干燥箱(杭州卓馳儀器有限公司);H1850臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.2 試劑

胃蛋白酶，胰蛋白酶硫，雙硫腙，鹽酸羥胺，乙二胺四乙酸二鈉，氯仿，氨水，高錳酸鉀，鹽酸，硫酸，硝酸，氫氧化鈉，磷酸二氫鉀等均為分析純。

1.3 藥品

銀朱(湖南省湘潭市滴水化工廠);黑辰砂(內蒙古呼和浩特市蒙藥研究所);納米銀朱(內蒙古醫學院無機化學專題室合成);清肺十八味丸(內蒙古蒙藥股份有限公司);硝酸汞。

2 實驗方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 0.65%(m/V)雙硫腙氯仿貯備液:稱取 0.65g雙硫腙溶于100mL三氯甲烷，貯于棕色瓶中，存于暗處。

2.1.2 0.026%(m/V)雙硫腙工作液:吸取2ml雙硫腙貯備液于分液漏斗中，加入2%氨水50mL，振搖萃取，棄去有機相，水相提取液過濾后即得。此液需在臨用時配制。

2.1.3 汞標準貯備液:稱取在硫酸銅干燥器中放置過夜的0.1646g硝酸汞，用去離子水溶解后，轉移至100mL容量瓶中，再用去離子水稀釋至標線，搖勻。此溶液每毫升含0.9897mg汞。

2.1.4 汞標準使用溶液:吸取汞標準貯備液1.00mL，注入100mL容量瓶，用1%硝酸溶液稀釋至標線，搖勻。此溶液每毫升含9.897μg汞。

2.1.5 人工胃液:用去離子水稀釋13mol·L－1HCl至pH=1.50，現配現用。

2.1.6 胃蛋白酶液:稱取1.6g胃蛋白酶溶于10mL0.1mol·L－1HCl，配制成質量濃度為 0.16g·mL－1胃蛋白酶液，現配現用。

2.1.7 人工腸液:稱取 KH2PO46.8g，加去離子水500mL溶解，用 0.1mol·L－1NaOH 水溶液調節 pH 值至 6.8，現配現用。

2.1.8 胰蛋白酶液:稱取0.180g胰蛋白酶溶于45mL人工腸液，配制成胰蛋白酶質量濃度為0.004g·mL－1的胰蛋白酶液，現配現用。

2.1.9 含硫人工腸液:稱取每份樣品質量三分之一的硫粉溶于已配制的人工腸液中，現配現用。

2.1.1010 %(m/V)EDTA溶液:將10g分析純乙二胺四乙酸二鈉用去離子水溶解并稀釋至100ml。

2.1.11 6mol/L NaOH溶液:將24g分析純氫氧化鈉用去離子水溶解并稀釋至100mL。

2.1.12 5%(m/V)KMnO4溶液:將5g分析純高錳酸鉀用去離子水溶解并稀釋至100mL。

2.1.13 10%(m/V)鹽酸羥胺溶液:將10g分析純鹽酸羥胺用去離子水溶解并稀釋至100mL。

2.2 標準曲線的制備

于 8個 50ml容量瓶中，分別加入 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00mL 的汞標準使用液，每個容量瓶中加入10mL10%(m/V)EDTA溶液，搖勻后加入 8ml 6mol/L NaOH溶液，搖勻后加入2mL 0.026%(m/V)雙硫腙工作液，用去離子水稀釋至標線，搖勻，于551nm波長處測定吸光度。以試劑空白為參比，于551nm波長處測定吸光度。

表1 汞標準曲線數據

回歸方程:在0.2～1.6(?μ/ml)范圍內線性關系為:A=0.2955c+0.0127，r=1.0442.

2.3 銀朱、黑辰砂、納米銀朱、清肺十八味丸、硝酸汞的溶出

準確稱取銀朱、黑辰砂、納米銀朱、清肺十八味丸，硝酸汞一定量 (均做3個平行樣)，與不同溶出液500ml混合，將放于37℃，100r·min－1振搖，人工胃液、胃蛋白酶液中2h，人工腸液、胰蛋白酶液、含硫人工腸液中8h。再在室溫下，5000r·min－1離心10min，取上清液(除胃蛋白酶液組和胰蛋白酶液組)，待測;胃蛋白酶液組和胰蛋白酶液組則是先靜置至溶液分3層，將上清液和下層沉淀棄去，取中層含絮狀沉淀的溶出液，在室溫下，5000r·min－1離心10min，取上清液，待測。

為研究pH、蛋白質以及硫化物的影響，溶出液分別為用鹽酸和磷酸鹽緩沖液配制的不同pH的溶液，含不同蛋白質胃蛋白酶(pepsin)，胰蛋白酶(trypsin)的溶液及一定濃度的含硫人工腸液。

2.4 可溶性汞含量的測定

分別吸取25.00ml溶出液(除硝酸汞組)于50ml容量瓶中，依次加入10%(m/V)EDTA 10.00ml，6mol/L NaOH 8.00mL，0.026%(m/V)雙硫腙工作液 2.00mL，用去離子水稀釋至標線。以相應的試劑空白為參比，在551nm波長下測定吸光度。結果見表2、表3。

表2 胃液、胃蛋白酶液中藥品溶出數據

表3 腸液、胰蛋白酶液、含硫腸液中藥品溶出數據

3 討論

3.1 pH對汞溶出的影響

試驗結果(見表4)表明，pH對銀朱、黑辰砂、納米銀朱和清肺十八味丸中汞的溶出量有較大的影響，隨著 pH的降低，汞的溶出量明顯增加。人工胃液中(pH=1.5)汞的溶出量明顯大于人工腸液(pH=6.8)。這可能是由于銀朱礦物中含有了其他形式的汞化合物雜質而造成的。

表4 人工胃液和人工腸液汞溶出量比較

3.2 胃蛋白酶和胰蛋白酶對汞溶出的影響

在消化道存在胃蛋白酶和胰蛋白酶，這些物質特別是含巰基的物質對于汞均有結合能力。因此本試驗研究了胃蛋白酶和胰蛋白酶對銀朱、黑辰砂、納米銀朱和清肺十八味丸中汞的溶出量的影響，試驗結果(見表5)表明，胃蛋白酶和胰蛋白酶對汞溶出量有一定的促進作用，但是不夠明顯。

3.3 硫對汞溶出的影響

由于腸內經細菌代謝后會產生硫化物，而HgS具有與硫形成多硫化物的性質，所以本試驗研究了人工腸液中加入硫粉對汞溶出的影響。試驗結果(見表6)表明，人工腸液中加入硫粉對銀朱、黑辰砂、納米銀朱和清肺十八味丸中汞的溶出有較強的助溶作用。

表5 人工胃液和人工腸液加酶前后汞溶出量比較

表6 人工腸液和加硫人工腸液汞溶出量比較

在人體腸道內存在形成汞多硫化物的條件，包括弱堿性環境和腸內細菌分解所產生的大量 H2S(主要以 HS－的形式存在)。因此可以推測，多硫化汞配合物可能是銀朱在體內的一種重要形式。

3.4 溶出液中微粒的存在和粒度分布對汞溶出的影響

為觀察HgS溶出的形式是可溶性物質還是懸浮微粒，分別對銀朱和納米銀朱在人工胃液、胃蛋白酶液、人工腸液、胰蛋白酶液和含硫人工腸液進行溶出試驗，試驗結果(見表7)表明，含硫人工腸液對納米銀朱中汞溶出的影響顯著，汞的溶出量約為銀朱中的15倍。

表7 銀朱和納米銀朱汞溶出量比較

4 結論

通過比較胃腸道中存在的各種化學因素對銀朱、黑辰砂、納米銀朱、清肺十八味丸中汞溶出的影響，得結果為pH對汞溶出量有較大的影響，蛋白質的促溶作用有限，硫對汞溶出量的影響顯著高于其他，納米銀朱對含硫人工腸液中汞溶出的影響顯著。提示銀朱在腸道中的形式可能為汞的各種含硫配合物;至于汞的含硫配合物能否在腸道中吸收并發揮藥理作用還有待進一步去證實。

〔1〕梁愛華，商敏鳳.朱砂的毒性研究概況〔J〕.中國中藥雜志，2005，30(4):249.

〔2〕陳飛霞，魏世強.汞的毒理學研究進展〔J〕.云南環境科學，2005，24(增刊1):14－17.

〔3〕梁國剛，張啟偉.朱砂、雄黃中各成分的溶解度對其藥效、毒副作用的影響〔J〕.中國中藥雜志，2002，27(5):391.

〔4〕Jenny A J，Fran coisM M，H arold F H .Mercury speciation in the presence of poly slfid es〔J〕.Environ Sci Technol，2000，34:2196.

〔5〕曾克武，王旗，楊曉達，等.朱砂溶出的體外研究〔J〕.中國中藥雜志，2007，32(3):233.

〔6〕倪坤儀，耿惠珍，程光，等.雙硫腙水相比色法測定含朱砂中成藥中微量汞〔J〕.中國藥科大學報，1996，27(12):726.

〔7〕齊惠杰，琳靜，等.特色蒙藥材黑辰砂物理常數與組分測定〔J〕.中國民族醫藥雜志.2008，12:60.

〔8〕任大喜，郭鸰，霍貴成.體外模擬法研究生物利用率的影響因素〔J〕.食品科技，2007，3:12.

〔9〕梁淑軒，龐秀言.人體內汞分子形態的轉化〔J〕.河北大學學報(自然科學版)，1999，3(19):1.