Tricine電泳優化方法在針灸效應小分子蛋白檢測中的應用

尹磊淼,魏穎,王宇,冉君,劉曉燕,徐玉東,楊永清

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Tricine電泳優化方法在針灸效應小分子蛋白檢測中的應用

尹磊淼1,魏穎2,王宇1,冉君2,劉曉燕2,徐玉東1,楊永清2

(1.上海市針灸經絡研究所,上海 200030;2.上海中醫藥大學,上海 201203)

改進一種適合分離、鑒定針灸效應小分子蛋白的Tricine-SDS-PAGE電泳體系。研究調整分離膠中聚丙烯酰胺濃度和凝膠交聯度并加入適量甘油,從而優化Tricine電泳系統。與常規Glycine-SDS-PAGE電泳系統比較,分離膠聚丙烯酰胺濃度為l6.8%、交聯度為5.8%、含10.4%甘油的Tricine-SDS-PAGE電泳明顯減少10 kD分子量蛋白的彌散,成功分離了分子量為11.0 kD的S100A8和11.8 kD的S100A11等兩個針刺抗哮喘小分子蛋白。優化的Tricine-SDS-PAGE電泳系統可有效分離針灸效應小分子蛋白。

針灸效應;物質基礎研究;Tricine電泳;小分子蛋白

作為生命科學的分支之一,針灸學和分子生物學、神經生物學、系統生物學等學科相互交叉,相互推動,產生了針灸效應物質基礎研究等一系列新的研究方向和領域[1,2]。針灸效應物質基礎研究立足于生命現象的本質,研究不同針灸效應的響應基因和應答蛋白,闡釋相應的針灸效應生物學機制。這對保持我國在針灸研究領域的國際領先地位,率先在針灸研究領域擁有原創性的自主知識產權具有重要的戰略意義[3]。針灸效應物質基礎研究常用技術手段有高效液相色譜[4],蛋白質雙向電泳技術,基因芯片、基因表達連續分析(serial analysis of gene expression,SAGE)技術[5]等。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)因操作簡便,測定快速,重復性好,上樣量少等特點在針刺效應蛋白質的分離、分析、純化、鑒定等實驗中具有廣泛的用途。SDS-PAGE電泳系統的有效分離范圍取決于聚丙烯酰胺的濃度和交聯度,并受尿素、甘油或蔗糖等可降低聚丙烯酰胺凝膠孔徑的溶質分子影響;其次,調整和選擇電泳緩沖液中拖尾離子的種類和濃度,也可以達到改善小分子蛋白質和多肽的分離效果[6,7]。

在前期研究中,我們課題組利用SAGE技術相繼發現了雙特異性磷酸酶1(DUSP-1)、金屬硫蛋白-2 (MT-2)、S100鈣結合蛋白A8(S100A8)和S100A11等一系列針刺抗哮喘效應蛋白[8]。然而MT-2、S100A8、S100A11等蛋白分子量較小,利用普通SDS-PAGE電泳常常難以獲得較好的觀察和分析結果。本研究擬調整聚丙烯酰胺的濃度和交聯度,并適量增加甘油降低凝膠孔徑,采用三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)作為拖尾離子,利用快速考馬斯亮藍染色方法,嘗試建立了一種滿足小分子量蛋白檢測需要的電泳方法,從而配合其他分子生物學技術的開展,并為深入開展針灸效應物質基礎研究提供可靠的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

丙烯酰銨、甲叉雙丙烯酰銨(Bis-Acrylamide)、過硫酸銨(APS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)等均購自美國Bio-Rad公司;Tricine、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自美國Amresco公司;甘油、鹽酸(HCL)購自國藥集團化學試劑有限公司;溴酚藍購自上海升正生物技術有限公司;GelCode Blue Stain染色試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司。pHS-3TC(0.01級)精密數顯pH計購自上海天達儀器有限公司;小型垂直電泳槽、Gel-Doc凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司;蛋白質分子量Marker購自MBI Fermentas公司。S100A8和S100A11蛋白由前期課題組通過基因表達和蛋白分離純化技術所得。

1.2 溶液配制

1.2.1 凝膠儲備液的配制

本研究中的Tricine電泳系統中共有兩種不同濃度和交聯度的凝膠貯存液,按配制稱取不同重量的丙烯酰銨和甲叉雙丙烯酰銨,將其溶于100 mL雙蒸水,混勻,4℃保存。詳見表1。

表1 Tricine-SDS-PAGE電泳凝膠儲備液的配制

1.2.2 電泳緩沖液的配制

Tricine-SDS-PAGE電泳緩沖液共有兩種,為電極緩沖液和凝膠緩沖液。電極緩沖液不同于常規SDS-PAGE電泳,其陽極緩沖液(即下牙槽緩沖液)僅由Tris鹽組成,pH值較高,為8.90。陰極緩沖液(即上牙槽緩沖液)除Tris鹽外,還有Tricine和SDS,pH值較低,為8.25。凝膠緩沖液包括分離膠和濃縮膠緩沖液,前者由3.0 M的Tris鹽和0.3% SDS組成,pH值為8.90;后者僅含Tris鹽,并用HCl將pH調至6.80。詳見表2。

表2 Tricine-SDS-PAGE電泳緩沖液的配制

1.2.3 分離膠、成層膠和濃縮膠的配制

根據所需膠濃度配制如下溶液,混勻后均勻灌入組裝好的電泳玻璃膠架中。利用水依次封閉各層膠面,當膠與水出現清晰界限時表明聚合已經完成。待膠聚合后用濾紙吸干水,繼續下一層膠的灌制。詳見表3。

表3 Tricine-SDS-PAGE電泳凝膠的配制

1.2.4 2×SDS上樣緩沖液的配制

按要求配制2×SDS上樣緩沖液,混勻后－20℃保存。詳見表4。

表4 2×SDS上樣緩沖液配制

1.3 蛋白上樣、電泳參數和染色

在蛋白樣品中加入2×SDS上樣緩沖液,100℃煮沸5 min,均勻混合樣品,使蛋白質與SDS充分結合。準備好電泳裝置,外槽加入陽極電泳緩沖液,內槽加入陰極電泳緩沖液,利用上樣細槍頭將蛋白樣品加入凝膠的點樣孔中,恒壓80 V,開始電泳。待指示帶跑入分離膠時,更換為120 V恒定電壓。電泳結束后取下電泳膠,利用快速考馬斯亮藍染色方法染色1 h。該染料只對蛋白質染色,不需要脫色,可以直接肉眼觀察。待條帶清晰顯現后,掃描保存圖片。

2 結果

2.1 濃度為l6.8%和交聯度為5.8%分離膠的建立

分離膠是Tricine-SDS-PAGE電泳系統的主要載體,起著重要的分子篩作用,而分離膠的濃度在很大程度上直接決定著蛋白分離效果的優劣。分離膠濃度是指100 mg凝膠溶液中含有單體(丙烯酰胺)和交聯劑(甲叉雙丙烯酰銨)的總克數。不同濃度的分離膠通過控制凝膠孔徑的大小,從而影響樣品的分離效果。提高分離膠濃度,其對小分子蛋白的分離效果也隨之提高。然而膠濃度并不是越高越好,當分離膠濃度提高到25.0%時,由于分離膠孔徑太小,電泳反而受阻。通過比較,本實驗確定分離膠濃度為16.8%。

交聯度是指凝膠溶液中,交聯劑(甲叉雙丙烯酰銨)占單體(丙烯酰胺)和交聯劑總量的百分數。合適的交聯劑和單體比例很重要。為了制作富有彈性、透明的凝膠,通過比較,本實驗確定分離膠交聯度為5.8%。

2.2 SDS-PAGE電泳和Tricine-SDS-PAGE電泳結果比較

常規SDS-PAGE電泳難以有效濃縮、分辨10 kD左右的蛋白條帶。在常規SDS-PAGE電泳圖中,10 kD分子量條帶無法得到有效濃縮,條帶彌散(圖1A箭頭處所示),且相應蛋白條帶模糊不清楚(圖1A)。

Tricine-SDS-PAGE電泳采用Tricine代替甘氨酸作為尾隨離子,通過16.8%分離膠、10.1%成層膠和6.6%濃縮膠的組合,利用10.4%甘油降低聚丙烯酰胺凝膠孔徑,從而較好地濃縮了10 kD分子量條帶(圖1B、C箭頭處所示),有效清晰地分離出分子量為11.0 kD的S100A8(圖1B)和11.8 kD的S100A11(圖1C)等兩個針刺抗哮喘小分子蛋白。圖中M為分子量Marker。

圖1 SDS-PAGE電泳和Tricine-SDS-PAGE電泳結果比較圖

3 討論

針灸效應物質基礎研究常借鑒蛋白質組學、基因組學等高通量方法從整體層面上觀察和分析針灸效應響應基因、應答蛋白及其相互作用機制[9]。隨著研究深入,發現越來越多的小分子蛋白在針刺抗哮喘效應物質研究和針刺預防1型糖尿病效應物質研究中起著至關重要的作用[8,10]。因此建立一種快速、有效的檢測小分子蛋白方法,已成為實驗研究體系不可缺少的組成部分之一。

SDS-PAGE電泳分辨率除了受濃縮膠和分離膠的濃度、交聯度影響外,和緩沖液pH值,樣品制備方法等密切相關[11]。但要想獲得良好的小分子蛋白分辨率,首先就需要有效地對其進行濃縮。Schagger等利用Tricine-SDS-PAGE電泳系統成功地解決了分子量為1-100 kD蛋白的濃縮和分離問題[6]。本研究同樣采用解離常數為8.15的Tricine代替解離常數較高的Glycine(甘氨酸,解離常數pK為9.6)作為尾隨離子,可以使蛋白樣品更好地被壓縮。因為在濃縮膠中Tricine和Glycine均可跟隨氯離子形成前后兩條離子帶,從而把上樣蛋白壓縮。Tricine解離常數小,和先導氯離子靠得更為接近,可以把蛋白壓縮在更為狹窄的區域,其結果是對小分子蛋白質的濃縮更有效[12]。

Tricine-SDS-PAGE電泳系統較常規的SDS-PAGE系統相比,在濃縮膠和分離膠之間引入成層膠,其目的是使小分子蛋白質和多肽的條帶更加尖銳,避免彌散和拖尾。此外,由于小分子蛋白對染料的結合能力較弱、易擴散、著色較差,還需要使用快速蛋白染色。

本研究采用Tricine作為尾隨離子,構建濃度為l6.8%的分離膠、10.1%的成層膠和6.6%的濃縮膠,利用10.4%甘油降低聚丙烯酰胺凝膠孔徑,優化了Tricine-SDS-PAGE電泳系統,清晰分離了S100A8, S100A11等針刺抗哮喘小分子蛋白,上樣量小,重復性好。這為深入開展針灸效應物質基礎研究奠定了良好的實驗基礎。

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Application of Optimized Tricine Electrophoresis Method in Detecting Low Molecular Weight Proteins of Acupuncture Effect

-1,2,1,2,-2,-1,-2.

1.,200030,; 2.,201203,

To improve a Tricine-SDS-PAGE electrophoresis technology suitable for isolation and identification of low molecular weight proteins of acupuncture effect.Tricine electrophoresis system was optimized by adjusting polyacrylamide concentration and the crosslinking degree in separation gel and adding an appropriate amount of glycerol.Compared with conventional Glycine-SDS-PAGE electrophoresis system, Tricine-SDS-PAGE electrophoresis system containing separation gel with l6.8% polyacrylamide and 5.8% crosslinking degree, and 10.4% glycerol significantly reduced 10 kD protein dispersion and successfully isolated two low molecular weight anti-asthma proteins of acupuncture effect: S100A8 with molecular weight of 11.0 kD and S100A11 with molecular weight of 11.8 kD.The optimized Tricine-SDS-PAGE electrophoresis system can effectively isolate low molecular weight proteins of acupuncture effect.

Acupuncture effect; Material foundation research; Tricine electrophoresis; Low molecular weight protein

1005-0957(2012)03-0191-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.03.191

2011-11-23

國家自然科學基金(81001548,30873299,81173341, 81173332);上海市教委和上海市教育發展基金會“晨光計劃”資助項目(10CG45);上海市衛生局青年基金(2009Y096);上海高校優秀青年教師科研基金(szy09022);上海市重點學科建設項目(S30304)

尹磊淼(1983 - ),男,助理研究員,博士,博士后,E-mail: collegeylm@163.com

楊永清(1964 - ),男,研究員,博士,E-mail:dryqyang@163. com