局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠的代謝組學(xué)研究1）

夏鑫華，劉 梅，李 歡

缺血性卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）又稱急性缺血性腦血管病（acute ischemic cerebral disease，AICD），處理缺血性腦損傷的原則是盡早恢復(fù)血液再灌注［1］。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury CIRI）死亡率更高，大大降低了治療效果。

代謝組學(xué)研究的是生物體各種細(xì)胞整合在一起的代謝物變化，以生物體的體液或組織為研究對(duì)象，著重強(qiáng)調(diào)生物體的代謝物譜在疾病或環(huán)境刺激下的整體應(yīng)激和變化［2］。通過(guò)疾病引起的代謝物輪廓譜變化的分析，能夠幫助更好地理解疾病的病變過(guò)程及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑，同時(shí)也有助于疾病的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和達(dá)到輔助臨床診斷的目的［3］。氣相色譜－質(zhì)譜（GCMS）方法具有高性能的毛細(xì)管柱，再加上高靈敏度的質(zhì)譜檢測(cè)，GC－MS不僅可以用來(lái)分析大多數(shù)的揮發(fā)性化合物，而且可以通過(guò)化學(xué)衍生化方法，分析許多半揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝物，被視為一種有用的代謝輪廓分析技術(shù)。

本文旨在利用已經(jīng)建立GC－MS技術(shù)結(jié)合樣品的衍生化反應(yīng)的方法，獲得正常大鼠和局灶性腦缺血模型大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物指紋圖譜，并從代謝組學(xué)角度，利用主成分析方法探討正常大鼠和模型大鼠血漿中代謝物的差異，以期發(fā)現(xiàn)腦缺血模型的生物標(biāo)志物，為篩選治療中風(fēng)藥物提供新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑 Agilent 6890N／5973N氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有Agilent7683自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent DB－5MS毛細(xì)管柱（30m×250μm×0.25mm），Agilent色譜工作站和NIST2002質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。N，O－雙（三甲基硅烷基）乙酰胺（BSTFA）和吡啶均為色譜純，購(gòu)于阿拉丁試劑公司，其余試劑均為分析純。

1.2 動(dòng)物模型制備和生物樣品取樣 SPF級(jí)SD大鼠10只，體重200g±20g，購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物每籠5只群養(yǎng)，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，室內(nèi)溫度保持為（22±2）℃，相對(duì)濕度保持為30%～40%，喂常規(guī)飼料，自由進(jìn)食飲水，造模。

建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞局灶性缺血模型。分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈。動(dòng)脈夾夾閉右頸總動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈距結(jié)扎處近心端約0.5cm處用注射器針頭刺一小口，牽拉頸外動(dòng)脈近心端至與頸內(nèi)動(dòng)脈成一直線。將尼龍線栓經(jīng)右側(cè)頸外動(dòng)脈主干切口緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈入顱方向推進(jìn)，以頸總動(dòng)脈分叉處為標(biāo)記，推進(jìn)18mm～20mm感到輕微阻力時(shí)，即已阻斷大腦中動(dòng)脈。完成腦缺血模型。

血漿樣本的獲取，取SPF大鼠，分別于再灌注后12h、24 h、48h和72h后，眼眶取血，血液中加入1%肝素抗凝，離心10 min（10 000r／min），移取血漿置于－80℃下保存。

1.3 生物樣品制備 取200μL凍后樣本，加入200μL乙腈沉淀蛋白，冰浴超聲10min后，離心分離10min。取上清置GC進(jìn)樣瓶，氮?dú)獯蹈伞＜友苌噭〣STFA 30μL，混勻，70℃下肟化1h，靜置1h。

1.4 GC－MS條件 進(jìn)樣量，1μL；進(jìn)樣口溫度，270℃；載氣，超純氦（99.999 6%）；流量，1mL／min；接口溫度：260 ℃；色譜柱DB－5MS毛細(xì)管柱；不分流進(jìn)樣。升溫程序見(jiàn)表1。質(zhì)譜條件，離子源溫度，200℃；檢測(cè)質(zhì)荷比范圍30～600；溶劑延時(shí)，5 min；掃描速度：20張圖譜／秒。

表1 GC／MS色譜柱溫箱升溫程序

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度和重復(fù)性 分別對(duì)同一制備好血漿樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算主要共有峰的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。血漿樣品中29個(gè)主要共有峰的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍1.38%～6.78%，全部共有峰的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。說(shuō)明儀器精密度良好。平行制備血液樣品各6份，分別測(cè)定，計(jì)算主要共有峰的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，血漿樣品的主要共有峰相對(duì)偏差2.14%～13.36%。說(shuō)明該樣品制備方法重復(fù)性良好。

2.1.2 樣品穩(wěn)定性 考察樣品在凍融過(guò)程中的穩(wěn)定性。取血漿樣品按照1.3項(xiàng)下制備供試品各3份，經(jīng)過(guò)一個(gè)凍融循環(huán)后，再取同樣樣品采用相同方法制備供試品各3份。血液供試品6份，GC－MS測(cè)定，并計(jì)算主要共有峰的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，主要共有峰的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%，說(shuō)明樣品在一個(gè)凍融循環(huán)周期能保持穩(wěn)定。

2.2 正常組大鼠血液樣本的代謝指紋譜 正常大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)鑒定主要基于NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，在數(shù)據(jù)庫(kù)匹配中，根據(jù)匹配度和可能性來(lái)鑒定指紋譜中的色譜峰所代表的物質(zhì)。選擇匹配度大于900，并且可能性大于80%，基本上可表明該物質(zhì)的鑒定結(jié)果具有較強(qiáng)的可信度。

本實(shí)驗(yàn)從大鼠血漿中共鑒定了29種化學(xué)物質(zhì)，主要為氨基酸、有機(jī)酸、糖類(lèi)、脂肪酸和固醇類(lèi)等物質(zhì)。這些物質(zhì)經(jīng)過(guò)NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定，均具有較高的匹配度和可信度。鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 正常大鼠血漿中代謝物組分GC／MS總離子流圖

同時(shí)，對(duì)四批次正常大鼠的血漿代謝物指紋譜進(jìn)行了分析和物質(zhì)鑒定，結(jié)果如圖1所示，經(jīng)過(guò)指紋圖譜相似度軟件評(píng)價(jià)，其指紋圖譜相似度為1.000，說(shuō)明大鼠血漿代謝物譜的物質(zhì)組成基本一致，主要是由氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸和固醇類(lèi)等組成。不同批次大鼠之間的血漿代謝物指紋圖譜基本無(wú)差異，個(gè)體差異基本不影響大鼠血漿代謝物譜的獲得。

2.3 模型大鼠血漿代謝物指紋譜 本實(shí)驗(yàn)建立的GC／MS分析方法應(yīng)用于線栓法制備的大鼠模型代謝組學(xué)研究，代謝物指紋圖譜詳見(jiàn)圖2。同時(shí)利用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定模型大鼠血漿中的內(nèi)源性代謝物，運(yùn)用主成分分析法（PCA）識(shí)別代謝物譜隨腦缺血時(shí)間變化規(guī)律。如圖2所示，腦缺血12h、24h、48h和72h的代謝物譜與空白血漿代謝物譜進(jìn)行對(duì)比，圖譜中色譜峰的分布基本一致，空白血漿中鑒定的29個(gè)代謝物在模型大鼠血漿代謝物譜中也能夠找到，說(shuō)明建立的分析方法具有很好的重現(xiàn)性。

圖2 局灶性腦缺血模型大鼠缺血不同時(shí)間的血漿代謝物指紋譜

2.4 正常大鼠與模型大鼠血漿代謝指紋圖譜差異 大鼠腦缺血2h麻醉清醒后，表現(xiàn)為不同程度的局灶性神經(jīng)功能障礙。如聳毛，左上肢屈曲內(nèi)收，提尾向前爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈（追尾征），向左側(cè)傾倒，側(cè)推抵抗力下降，蜷臥少動(dòng)等；再灌注4h～6 h后局灶性神經(jīng)功能障礙癥狀如左上肢屈曲內(nèi)收，及提尾向前爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或向左側(cè)傾倒等基本消失，雙側(cè)抗側(cè)推抵抗力基本相同，僅表現(xiàn)為聳毛，蜷臥少動(dòng)。

大鼠處死后取腦肉眼觀察，正常組腦組織顏色形態(tài)均正常，無(wú)蒼白及腫脹。腦缺血2h再灌注24h后缺血側(cè)大腦組織腫脹明顯，顏色變淺，軟腦膜血管有出血。光鏡下觀察，正常組腦神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核較大，核仁清楚，細(xì)胞及間質(zhì)無(wú)水腫；腦缺血2h再灌注2h組腦神經(jīng)細(xì)胞多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞核固縮，核仁顯示不清，細(xì)胞外空隙明顯增寬，間質(zhì)疏松，顯示細(xì)胞周?chē)伴g質(zhì)水腫。

從代謝角度，上述的生理變化主要體現(xiàn)為生物體液中各種代謝物的改變。根據(jù)獲得的正常和模型大鼠代謝物GC／MS指紋譜，采用主成分分析法（PCA）對(duì)正常大鼠與模型大鼠血漿代謝物指紋圖譜差異進(jìn)行分析，PCA是目前代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理中最常用的方法之一，能夠?qū)⒃瓟?shù)據(jù)的高維樣本點(diǎn)投影到是少數(shù)就幾個(gè)主成分上，最大限度地提取原變量的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)信息，從而達(dá)到數(shù)據(jù)降維。正常組和模型組的樣本點(diǎn)完全分離，且各組內(nèi)樣本點(diǎn)聚集較好，說(shuō)明模型組大鼠生理及物質(zhì)代謝狀況已經(jīng)發(fā)生了明顯改變，與行為學(xué)觀察及手術(shù)觀察結(jié)果一致。

2.5 不同時(shí)間點(diǎn)模型大鼠血漿代謝物指紋圖譜差異 不同時(shí)間組與正常組的偏離程度不同，呈現(xiàn)一定的規(guī)律，表明代謝物譜模式變化與腦缺血時(shí)間相關(guān)，可以清楚地顯示腦缺血模型隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，缺血程度逐漸減輕，腦梗死逐漸恢復(fù)的變化過(guò)程。與腦缺血模型的行為學(xué)觀察比較一致（隨著時(shí)間延長(zhǎng)，中風(fēng)行為學(xué)癥狀逐漸減輕）。12h和24h組均偏離正常組較遠(yuǎn)，表明腦缺血損傷嚴(yán)重；48h開(kāi)始接近對(duì)照組，呈現(xiàn)恢復(fù)趨勢(shì)；72h與正常組基本接近，表明缺血損傷已經(jīng)開(kāi)始恢復(fù)。

2.6 重要化合物的差異 根據(jù)測(cè)得的正常組和模型組血漿代謝物指紋圖譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)14個(gè)在兩組間變化非常明顯的化合物，以加入的內(nèi)標(biāo)二十二烷為參照，分別計(jì)算這14個(gè)峰的相對(duì)峰面積。12個(gè)主要代謝物相對(duì)峰面積在正常組和模型組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中血漿中的氨基酸比正常組有顯著降低，說(shuō)明腦缺血引起的細(xì)胞損傷應(yīng)該與氨基酸的代謝紊亂有關(guān)系。可初步認(rèn)為這12個(gè)變化顯著的化合物為腦缺血再灌注損傷的生物標(biāo)志物。詳見(jiàn)表2。

表2 血漿中重要的代謝物在正常組和模型組中相對(duì)峰面積（n＝5）

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)利用建立的GC／MS代謝組學(xué)分析方法應(yīng)用于局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型的代謝組學(xué)研究，利用GC／MS技術(shù)檢測(cè)血漿中的內(nèi)源性代謝物，并采用主成分分析法對(duì)所獲得的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別。研究結(jié)果顯示，隨著缺血時(shí)間的推移，大鼠血漿的GC／MS代謝物指紋譜存在著一定的變化規(guī)律，部分游離氨基酸等代謝物在不同缺血時(shí)間之間呈現(xiàn)顯著差異。以腦組織病理檢查結(jié)果作對(duì)照，發(fā)現(xiàn)上述變化都與腦損傷程度密切相關(guān)。說(shuō)明基于GC／MS的代謝組學(xué)方法能有效識(shí)別因生理狀態(tài)改變而紊亂的代謝模式差異。

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