電針對阿爾茨海默病大鼠學習記憶力改善及海馬神經元損傷保護的作用及機制

國海東,邵水金,朱晶,陸萍萍

?

電針對阿爾茨海默病大鼠學習記憶力改善及海馬神經元損傷保護的作用及機制

國海東,邵水金,朱晶,陸萍萍

(上海中醫藥大學基礎醫學院解剖教研室,上海 201203)

探討電針保護海馬神經元和改善阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)大鼠學習記憶力的作用機制。將大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組和電針組,采用Morris水迷宮檢測空間學習和記憶能力的變化。Hoechest33342染色觀察各組海馬神經元的凋亡;Western blot檢測Bcl-2和Bax的水平;免疫組織化學染色分析Caspase-3陽性神經元的個數和光密度值。電針治療可明顯提高AD大鼠學習和記憶功能,并可降低海馬CA1區凋亡細胞的數目、上調Bcl-2的表達和下調Bax和凋亡執行蛋白Caspase-3的表達。電針可通過調節Bax和Bcl-2的平衡比值,降低Caspase-3的表達,對抗b-淀粉樣蛋白誘導的神經元凋亡,改善AD大鼠學習和記憶功能。

針刺療法;電針;阿爾茨海默病;大鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種漸進性的中樞神經系統的退行性變性病,以進行性記憶障礙、全面智能減退、個性改變以及精神行為異常為主要臨床表現,給患者、患者家屬以及整個社會帶來沉重的負擔。AD已是繼心血管疾病和腫瘤之后的老年人死亡的第三大病因[1]。在病理學上,AD以細胞外b-淀粉樣蛋白(amyloid-b,Ab)沉積形成的老年斑、細胞內的神經原纖維纏結和神經元及其突觸的缺失為典型特征,膽堿能神經元的丟失是引起進行性記憶和認知功能減退的根本原因。由于現代醫學對本病的發病原因和發病機制尚未充分闡明,相關治療藥物缺乏很好的特異性,臨床療效十分有限[2]。中醫學對AD的病理論述較為豐富[3]。針對AD復雜的多因素致病,中醫針灸治療具有多層面、多途徑、多靶點作用的優勢[4]。目前,諸多動物實驗和臨床試驗研究顯示,中醫針灸具有較好地治療AD的作用[4]。然而,針灸治療對AD的具體作用機制目前尚不十分清楚。本研究在構建AD大鼠模型的基礎上,采用電針治療,繼而從行為學、組織病理學與分子生物學等多方面探討電針保護海馬神經元和改善學習記憶力的作用機制,以期為AD的臨床治療提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

SPF級SD大鼠,體重(200±50)g,由上海中醫藥大學實驗動物中心提供;Ab1-40購自美國Sigma公司;兔抗大鼠Bcl-2/Bax多克隆抗體、兔抗大鼠Caspase-3單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記二抗均購自美國Santa Cruz公司;Hoechest33342染色購自碧云天生物技術研究所;SABC試劑盒購自美國Vector公司;生物素化山羊抗兔IgG購自美國Jackson Immuno Research公司;立體定位儀(江灣Ⅰ型)為第二軍醫大學生理教研室研制;Morris水迷宮為中國醫藥科學研究院研制。

1.2 AD動物模型建立

10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,將頭顱固定在腦立體定位儀上,消毒手術區皮膚,做正中切口暴露前囟,參照大鼠腦立體定位圖譜,以前囟為原點,向后3.5 mm,旁開2.0 mm為鉆孔點,鉆開左右兩個對稱的小孔,自腦顱骨表面進針3.0 mm至海馬,用微量進樣器抽取2ml(10mg)Ab1-40(37℃孵育1星期,使其變為聚集狀態[5]),每點注射lml(5mg),緩慢進針,5 min內注射完畢,注射完畢后停針5 min,緩慢拔針,縫合皮膚,術后肌肉注射青霉素,連續3 d,以防感染。假手術組注射等量生理鹽水。

1.3 分組及治療

7 d傷口完全愈合后,飲食正常,無肢體殘疾,即開始治療。實驗分正常組、假手術組、模型組和電針組4組,每組20只。在電針組,取百會(頂骨正中)和涌泉(于大鼠足底大趾與次趾之間向后2 mm處),采用0.35 mm×13 mm不銹鋼毫針,百會穴平刺約2.5 mm;涌泉穴直刺進針1.5 mm;連接G6805A型電針治療儀,選擇連續波,頻率為20 Hz,強度以肢體抖動,且大鼠能安靜耐受為度。針刺治療每天1次,每次30 min,7 d為1個療程,療程間休息1 d,共治療4個療程。正常組、假手術組及模型組正常飼養,不予電針治療。

1.4 空間學習記憶力測試

采用Morris水迷宮測試大鼠逃避潛伏期和通過原平臺次數以檢測大鼠空間學習和記憶能力的變化[6]。歷時5 d,每天分別從2個不同的入水點將大鼠放入迷宮中,記錄其70 s內尋找平臺所需時間(逃避潛伏期)。若大鼠入水后70 s內未能找到平臺,則將其置于平臺上并停留20 s,引導學習記憶,逃避潛伏期記錄為70 s。實驗第6天撤除平臺,將大鼠面向池壁從任一入水點放入水池,測試70 s內跨越原平臺位置的次數。Morris水迷宮測試期間仍按2.2部分對大鼠進行治療處理。

1.5 Hoechest33342染色

Morris水迷宮測試完成后,部分動物經10%水合氯醛腹腔注射麻醉,打開腹腔,暴露心臟,將注射針頭插入左心室,剪開右心耳,快速灌注4℃生理鹽水,待右心耳處流出澄清液體,換4℃多聚甲醛灌注到大鼠四肢強直,快速斷頭取腦。將腦組織置于4%多聚甲醛中固定24 h,然后進行乙醇系列脫水、二甲苯透明、常規石蠟包埋。所有標本均以注射點為中心做連續冠狀切片,片厚5mm,所有切片均包含海馬區。取各組切片,脫蠟、水化后,滴加Hoechest33342染色液,室溫染色10 min,在熒光顯微鏡下觀察各組海馬神經元的凋亡情況。

1.6 Western blot檢測Bcl-2和Bax的水平

部分動物頸椎脫臼處死,快速取出海馬組織,加入RIPA buffer裂解液,提取總蛋白。按常規方法灌制聚丙烯酰胺凝膠,微量加樣器加樣后電泳。在半干轉印儀上轉膜30 min。取出PVDF膜,封閉液封閉2 h。倒掉封閉液,分別與一抗、二抗孵育,同時以GAPDH作為內參照。免疫印跡化學發光顯色,X片曝光,洗片。將膠片進行掃描,用凝膠圖像處理系統分析,計算蛋白質的相對表達量,方法為待測蛋白質的凈像素值/GADPH的凈像素。

1.7 Caspase-3染色組織化學染色

取各組切片,脫蠟、水化后,3%H2O2滅活內源性酶,蒸餾水洗滌,微波修復抗原;滴加正常山羊血清封閉液,室溫下反應20 min;分別滴加濃度為1:200的兔抗大鼠Caspase-3單克隆抗體,濕盒中孵育過夜,PBS沖洗3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG,37℃孵育30 min,滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC),濕盒中孵育20 min,DAB顯色,光鏡下控制顯色深度,脫水、透明、封片。以胞質中出現棕黃色顆粒為陽性細胞。用圖像分析軟件,對每只大鼠腦相同間隔的3張切片,每張切片各測5個視野,在相同的放大倍數(400×)、視場面積和背景光強度下,分別對各組大鼠海馬CA1區的Caspase-3陽性神經元進行計數。并運用圖像分析軟件測量各個視野Caspase-3陽性細胞的光密度值,計算每張切片的平均光密度值。

1.8 統計學方法

采用SPSS15統計軟件處理數據,各組間的差別采用單因素方差分析進行比較,結果用均數±標準差表示,以＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果比較

與正常組相比,AD模型組的平均逃避潛伏期時間顯著延長,撤除平臺后,AD模型組大鼠跨越原平臺的次數減少,兩組比較差異均具有統計學意義(＜0.01);與模型組相比,電針組大鼠逃避潛伏期的時間明顯縮短,跨越原平臺的次數明顯增加,差異均具有統計學意義(＜0.01),提示電針有改善AD大鼠學習和記憶能力的作用。詳見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.2 各組大鼠海馬CA1區細胞凋亡指數比較

Hoechest33342染色結果發現,正常組大鼠海馬CA1區僅可觀察到極少量凋亡細胞,而Ab注射可顯著增加CA1區凋亡細胞數目,模型組與正常組比較,差異具有統計學意義(＜0.01)。電針組海馬CA1區凋亡細胞的數目明顯降低,與模型組相比,差異具有統計學意義(＜0.01)。詳見圖1、表2。

圖1 各組大鼠Hoechest33342染色結果

表2 各組海馬CA1區細胞凋亡指數比較 (±s,%)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.3 各組大鼠海馬Bcl-2和Bax表達比較

由表3可見,模型組大鼠海馬組織中Bcl-2蛋白表達相對值較正常組顯著降低(＜0.01);電針組大鼠海馬組織中Bcl-2蛋白表達相對值與模型組比較,差異具有統計學意義(＜0.01),提示電針治療可上調Bcl-2蛋白的表達。模型組大鼠海馬組織中Bax蛋白表達相對值較正常組顯著增高(＜0.01);與模型組相比,電針組大鼠海馬組織中Bax蛋白表達相對值與模型組比較,差異具有統計學意義(＜0.01),提示電針組可下調Bax的表達。

表3 各組大鼠海馬Bcl-2和Bax表達比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.01

2.4 電針治療對大鼠海馬CA1區Caspase-3表達的影響

Caspase-3陽性反應產物主要沉積在海馬CAl和CA3區錐體細胞層,呈棕黃色或棕褐色細顆粒狀。由表4可見,模型組Caspase-3陽性細胞和平均光密度值與正常組比較,差異均具有統計學意義(＜0.01)。電針組Caspase-3陽性細胞和平均光密度值與模型組比較,差異均具有統計學意義(＜0.01),提示電針組Caspase- 3陽性神經元數量明顯減少,陽性反應產物的平均光密度值顯著降低。

表4 各組大鼠海馬CA1區Caspase-3陽性細胞計數及Caspase-3陽性產物平均光密度值比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

3 討論

中醫學對AD發病機理有著寶貴的經驗[3]。中醫學認為本病的發生與腎精虧虛、髓海失充有關,故腎虛血瘀、神明失養是其基本病機。經絡是構成腦髓氣血津液運行的通道,輸送精髓充實于腦,并為傳達腦神到人之五臟百骸之通路。根據“補腎通督、醒神益智”治療原則,結合經絡理論《難經·二十八難》:“督脈者……上至風府,入屬于腦”,本實驗選用督脈要穴百會和涌泉配伍治療,百會通督醒腦,涌泉為腎經之根,兩穴合用,既可補腎益髓,又可活血化瘀、開竅醒神,起到貫通氣血、疏通督脈和補腎益髓的作用。動物實驗和臨床證明,中醫針灸具有較好地治療AD的作用[4]。本實驗也發現,AD大鼠給電針治療后,在迷宮實驗中,逃避潛伏期時間明顯縮短,同時穿越原平臺次數明顯增加,表明電針可改善Ab1-40誘導的AD大鼠的學習和記憶功能。

神經元凋亡是造成AD神經元丟失的主要途徑,同時也是引起進行性記憶和認知功能減退的根本原因。本研究發現,在正常組,大鼠海馬CA1區僅可觀察到極少量凋亡細胞;而Ab注射可顯著增加CA1區凋亡細胞數目。電針治療可明顯降低海馬CA1區凋亡細胞的數目;與模型組相比,電針組凋亡細胞數目明顯減少。本實驗表明AD大鼠予以電針治療可能通過拮抗Ab的神經毒性作用,保護神經元對抗凋亡,進而減輕AD的病理改變。

細胞凋亡不僅為機體維持正常生理所必需,而且與許多疾病的發生密切相關。Bcl-2可抑制多種類型的細胞凋亡,促細胞生存。而Bax是與Bcl-2功能相拮抗的一個基因,可促進凋亡發生。Bax和Bcl-2作為一個平衡體系,它們表達的比率在很大程度上影響著凋亡的發生[7]。研究表明,AD腦神經元凋亡過程中Bcl-2家族扮演著重要角色。Ab處理可誘導氧化應激,從而導致PC12細胞死亡。然而,轉染抗凋亡基因Bcl-2的PC12細胞抗損傷能力增強,其機制可能與Bcl-2促使過氧化氫酶的表達和活化,有效清除自由基有關[8]。本研究發現,Ab1-40海馬注射后,可誘導大鼠海馬結構Bcl -2蛋白表達降低,Bax蛋白表達升高;同時電針治療組Bcl-2表達較模型組增高,而促凋亡蛋白Bax表達較模型組降低。因此,我們推測電針抑制Ab神經毒性的機制可能與促進Bcl-2的表達和抑制Bax的表達有關,電針通過調節Bax和Bcl-2之間的平衡,減少神經元凋亡和丟失。

細胞凋亡雖然受高度程序化調控,但是其最終都是通過凋亡執行蛋白Caspase-3實現[9]。在正常狀態下,細胞內Caspase-3以無活性的酶原形式存在于細胞漿。細胞凋亡時Caspase-3活化并且其表達隨著凋亡的不同階段發生重分布,在細胞凋亡的最后執行階段,Caspase-3進入細胞核,酶切細胞核內下游底物,促使染色質凝聚和核酶激活,導致細胞凋亡[10-11]。本實驗結果顯示,正常組僅有少量的Caspase-3陽性神經元,而模型組Caspase-3陽性神經元數量明顯增多,陽性反應產物著色顯著加深,平均光密度值較對照組顯著增高。與AD模型組相比,電針組Caspase-3陽性神經元數量明顯減少,陽性反應產物的平均光密度值顯著降低。結果表明電針治療可下調Caspase-3的表達,從而抑制Ab誘導的神經元凋亡,這可能是其抗細胞凋亡作用機制的環節之一。

綜上所述,電針治療可通過上調海馬結構抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,下調促凋亡蛋白Bax的表達,調節Bax和Bcl-2的平衡比值,降低凋亡執行蛋白Caspase- 3的表達等環節,對抗Ab誘導的神經元凋亡,提高AD大鼠學習記憶功能。本研究可為推廣電針治療AD以及闡明電針治療AD的作用機制提供理論基礎和實驗依據。

[1] Torreilles F, Touchon J. Pathogenic theories and intrathecal analysis of the sporadic form of Alzheimer's disease[J]. Prog Neurobiol, 2002,66 (3):191-203.

[2] Grill JD, Cummings JL. Current therapeutic targets for the treatment of Alzheimer’s disease[J]. Expert Rev Neurother, 2010,10(5):711- 728.

[3] 蘇芮,韓振蘊,范吉平.阿爾茨海默病中醫病因病機探討[J].中華中醫藥雜志(原中國醫藥學報),2010,25(5):743-744.

[4] 代淵,王飛,徐世軍.中醫治療阿爾茨海默病優勢述略[J].中國中醫藥信息雜志,2010,17(8):5-6.

[5] Frautschy SA, Yang F, Calderón L,. Rodent models of Alzh- eimer’s disease: rat A beta infusion approaches to amyloid deposits[J]. Neurobiol Aging, 1996,17(2):311-321.

[6] Morris R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat[J]. J Neurosci Methods, 1984,11(1):47 -60.

[7] Dey S, Mactutus CF, Booze RM,. Cocaine exposure in vitro induces apoptosis in fetal locus coeruleus neurons by altering the Bax/Bcl-2 ratio and through caspase-3 apoptotic signaling[J]. Neuroscience, 2007,144(2):509-521.

[8] Jang JH, Surh YJ. Bcl-2 protects against Abeta (25-35)-induced oxid- etive PC12 cell death by potentiation of antioxidant capacity[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,320(3):880-886.

[9] Yatin SM, Varadarajan S, Link CD,. In vitro and in vivo oxi- dative stress associated with Alzheimer’s amyloid beta-peptide (1- 42) [J]. Neurobiol Aging, 1999,20(3):325-330.

[10] Kamada S, Kikkawa U, Tsujimoto Y,. Nuclear translocation of caspase-3 is dependent on its proteolytic activation and recognition of a substrate-like protein (s) [J]. J Biol Chem, 2005,280(2):857-860.

[11] Schindler CK, Pearson EG, Bonner HP,. Caspase-3 cleavage and nuclear localization of caspase-activated DNase in human temporal lobe epilepsy[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2006,26(4):583-589.

Mechanism of Action of Electroacupuncture in Improving Learning and Memory and Protecting Injured Hippocampal Neuron in Alzheimer’s Disease Rats

-,-,,-.

,,201203,

To investigate the mechanism of action of electroacupuncture in improving learning and memory and protecting injured hippocampal neuron in Alzheimer's disease (AD) rats.The rats were randomized into normal, sham operation, model and electroacupuncture groups. Spatial learning and memory were assessed using a Morris water maze. Change of learning and memory abilities was detected by Morris water maze. Apoptosis of hippocampal neurons was examined by hoechest 33342 staining. Bcl-2 and Bax levels were measured by Western blot analysis. The number and optical density value of Caspase-3-positive neurons were determined by Immunohistochemical staining.Electroacupuncture can significantly improve AD rat learning and memory function, and reduce the number of apoptotic cells in the hippocampal CA1 region, upregulate the expression of Bcl-2 and downregulate the expressions of Bax and apoptosis execution protein Caspase-3.Electroacupuncture can improve AD rat learning and memory function through regulating the balance ratio between Bax and Bcl-2, reducing Caspase-3 expression and counteractingb-amyloid protein-induced neuronal apoptosis.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Alzheimer’s disease; Rats

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.09.682

1005-0957(2012)09-0682-04

國家自然科學基金項目(81102670);上海市教育委員會預算內科研項目(2010JW03);上海市教育委員會重點學科建設項目(J50301)

國海東(1981 - ),男,助理研究員,博士

2012-05-30