馬鈴薯種質(zhì)離體保存技術(shù)

岳新麗，湛潤(rùn)生，帥媛媛，陳 云

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所，山西 大同 037008；2.大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009）

近年來，植物種質(zhì)資源流失的情況越來越嚴(yán)重，植物種質(zhì)資源保存已成為全球性關(guān)注的課題[1]。緩慢生長(zhǎng)離體保存被證明是行之有效的種質(zhì)保存方法，以組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，通過改變培養(yǎng)物生長(zhǎng)的外界環(huán)境條件，使細(xì)胞生長(zhǎng)降至最小限度，以延長(zhǎng)繼代間隔時(shí)間，減少繼代次數(shù)，實(shí)現(xiàn)植物種質(zhì)資源的中長(zhǎng)期保存目的[2]，此法已經(jīng)成功地應(yīng)用于多種植物[3-4]。本文以馬鈴薯無菌苗為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，研究了蔗糖、多效唑（PP333）在常溫和低溫條件下對(duì)馬鈴薯試管苗離體保存的影響，以期為馬鈴薯種質(zhì)資源的離體保存提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所育成的新品種‘晉薯16號(hào)’無菌苗為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)培養(yǎng)

取整齊一致的馬鈴薯節(jié)間作為外植體，以MS+IAA 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L為基本培養(yǎng)基，在溫度25±1℃、光照時(shí)間為14h/d、光照強(qiáng)度1600～3000 lx條件下進(jìn)行增值擴(kuò)繁以備用。

1.2.2 蔗糖對(duì)馬鈴薯試管苗常溫保存的影響

以MS+IAA 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別添加蔗糖濃度10、30、50、70、90、110 g/L共6個(gè)試驗(yàn)處理，對(duì)馬鈴薯試管苗進(jìn)行保存。

1.2.3 PP333對(duì)馬鈴薯試管苗常溫保存的影響

以MS+蔗糖30g/L+IAA0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加不同PP333濃度0、0.5、1.0、1.5、3.0 mg/L共5個(gè)試驗(yàn)處理，對(duì)馬鈴薯試管苗進(jìn)行保存。

1.2.4 PP333對(duì)馬鈴薯試管苗低溫保存的影響

先將各處理的馬鈴薯試管苗在常規(guī)條件下培養(yǎng)10 d，再轉(zhuǎn)入4℃低溫冰箱里避光保存，培養(yǎng)基同1.2.3。

每試驗(yàn)處理接種10瓶，每瓶接種5株馬鈴薯無菌苗，共3次重復(fù)。試驗(yàn)材料為剪取1～1.5 cm長(zhǎng)帶葉莖段，插入培養(yǎng)基中進(jìn)行離體保存試驗(yàn)。培養(yǎng)溫度25±1℃、光照時(shí)間為14 h/d、光照強(qiáng)度為1000～1500 lx。連續(xù)培養(yǎng)保存150 d，每隔1個(gè)月檢查1次并且觀察記錄其生長(zhǎng)分化情況和保存存活率。

1.2.5 恢復(fù)生長(zhǎng)

將經(jīng)過離體保存后的馬鈴薯試管苗與1個(gè)月繼代1次正常培養(yǎng)的試管苗同時(shí)接種到繼代培養(yǎng)基中（MS+蔗糖30 g/L+IAA0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L），增殖培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)試管苗的高度，生長(zhǎng)情況。本試驗(yàn)均為單因子試驗(yàn)，各處理抽取5瓶掏出苗子洗凈根部培養(yǎng)基，隨機(jī)抽取5株，3次重復(fù)，數(shù)據(jù)取其平均值。方差分析采用鄧肯新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖對(duì)馬鈴薯試管苗常溫保存的影響

由圖1看出，10～50 g/L范圍的蔗糖處理馬鈴薯試管苗時(shí)，對(duì)試管苗的生長(zhǎng)沒有起到抑制作用，當(dāng)保存時(shí)間到150 d時(shí)，保存的馬鈴薯試管苗枯黃死亡，莖變細(xì)，根細(xì)長(zhǎng)發(fā)黃，培養(yǎng)基呈黑色。蔗糖濃度在50 g/L的培養(yǎng)基與正常蔗糖含量以及低濃度蔗糖（10 g/L）的培養(yǎng)基相比，對(duì)試管苗沒有抑制作用，但植株莖稈、根系粗壯，葉色深綠。但70～110 g/L范圍的蔗糖處理時(shí)，對(duì)試管苗生長(zhǎng)的抑制作用明顯。添加70 g/L和90 g/L蔗糖保存150 d后，試管苗較對(duì)照健壯，葉色綠，培養(yǎng)基無明顯變化，存活率為70.7%和87.3%，而110 g/L蔗糖的濃度過高，抑制作用過于強(qiáng)烈，致使試管苗的存活率下降至56.3%，保存期縮短。因此有利于保存馬鈴薯試管苗的蔗糖濃度是90 g/L。

圖1 不同濃度蔗糖對(duì)馬鈴薯試管苗常溫保存的影響Figure1 Effect of different concentrations of sucrose on preservation of tube-plantlets at room temperature

2.2 PP333對(duì)馬鈴薯試管苗常溫保存的影響

從圖2可以看出，不添加PP333的馬鈴薯試管苗120 d后全部死亡，而經(jīng)過PP333處理后，其成活率顯著提高。從總體上來看生長(zhǎng)延緩劑PP333對(duì)馬鈴薯試管苗的保存是具有抑制生長(zhǎng)的作用，濃度對(duì)試管苗保存的效果影響較大，低濃度的PP333可以促進(jìn)馬鈴薯試管苗的健壯生長(zhǎng)，其莖稈粗壯，根系發(fā)達(dá)，分枝增多，但保存的時(shí)間有限；高濃度的PP333使試管苗生長(zhǎng)緩慢，莖稈粗壯矮小，但試管苗的葉片數(shù)目增加，顏色加深，根變粗短而根數(shù)減少，并出現(xiàn)大量的叢生芽。當(dāng)生長(zhǎng)延緩劑PP333濃度為1.0 mg/L，試管苗保存的效果最好，連續(xù)保存5個(gè)月還有93%的試管苗存活；PP333濃度為1.5 mg/L和0.5 mg/L的處理次之，試管苗的存活率分別為74%、54%。當(dāng)濃度比較大幅度提高到3.0 mg/L，對(duì)試管苗表現(xiàn)出毒害作用，死苗現(xiàn)象嚴(yán)重，保存存活率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而快速下降。綜合分析認(rèn)為，生長(zhǎng)延緩劑PP333在馬鈴薯試管苗保存中應(yīng)用的適宜處理濃度為1.0 mg/L。

圖2 不同濃度PP333對(duì)馬鈴薯試管苗常溫保存的影響Figure2 Effect of different concentrations of PP333 on of preservation of tube-plantlets at room temperature

2.3 PP333對(duì)馬鈴薯試管苗低溫保存的影響

從圖3可以看出，4℃的低溫能顯著延長(zhǎng)所有不同 PP333濃度處理的馬鈴薯試管苗的離體保存時(shí)間。在低溫下，對(duì)照雖然沒有加入PP333，但由于低溫的作用，其保存時(shí)間也比常溫保存的時(shí)間要長(zhǎng)，至150 d時(shí)還有30.3%的成活率；在低溫下，低濃度的 PP333有利于提高試管苗的成活率，而高濃度的PP333則可對(duì)試管苗產(chǎn)生毒害，使其成活率下降，馬鈴薯試管苗低溫下保存的最佳PP333濃度為0.5 mg/L，低于常溫保存時(shí)的最佳濃度。可見，PP333對(duì)馬鈴薯試管苗的低溫保存效果優(yōu)于常溫保存。

圖3 不同濃度PP333對(duì)馬鈴薯試管苗低溫（4℃）保存的影響Figure3 Effect of different concentrations of PP333 on preservation of tube-plantlets at low temperature(4℃)

2.4 保存馬鈴薯試管苗的恢復(fù)生長(zhǎng)

選馬鈴薯離體保存試管苗各處理的最佳濃度進(jìn)行繼代培養(yǎng)。從表1可以看出，馬鈴薯試管苗經(jīng)保存處理后再生苗與對(duì)照常溫繼代苗在株高、莖粗、根的數(shù)量等方面差異不顯著，即對(duì)試管苗繼代生長(zhǎng)沒有影響。說明蔗糖、PP333用來保存馬鈴薯種質(zhì)是合適的，能夠保證遺傳資源的穩(wěn)定性。

表1 馬鈴薯離體保存后再生苗與繼代苗形態(tài)指標(biāo)的比較Table1 Morphological index of in vitro preservation regenerated plantlets and subculture plantlets

3 討論

本試驗(yàn)在培養(yǎng)基中添加低濃度的蔗糖對(duì)馬鈴薯的生長(zhǎng)沒有抑制作用，當(dāng)蔗糖濃度提高至70 g/L時(shí)，有效抑制了馬鈴薯的生長(zhǎng)。這是由于提高蔗糖濃度，使培養(yǎng)基的滲透壓超過了其承受范圍，使水分、養(yǎng)分吸收受阻，從而抑制了生長(zhǎng)。

本試驗(yàn)證明，在馬鈴薯的離體保存中，PP333的使用可以減緩試管苗的生長(zhǎng)速度，延緩繼代時(shí)間，從而能顯著提高馬鈴薯試管苗常、低溫保存的成活率，PP333濃度過高則容易產(chǎn)生毒害作用，成活率反而降低。這與PP333對(duì)草莓[5]的保存效果一致。

在試管苗離體保存中，低溫對(duì)試管苗生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，低溫下的成活率明顯高于常溫條件。因此，低溫處理是試管苗保存的常用方法[6]。本試驗(yàn)表明，在常溫25℃條件下，馬鈴薯試管苗保存150 d后成活率顯著低于4℃條件下試管苗的成活率。這與地黃[7]的低溫保存效果一致。

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