胚胎干細胞研究進展

文│閆益波 王福傳 李文剛（山西省農業科學院畜牧獸醫研究所）

胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ES細胞）是一種從早期胚胎的囊胚內細胞團（Inner Cell Mass，ICM）細胞或胎兒原始生殖細胞（primordial germ cells，PGCs）經分離、體外抑制分化培養得到的具有發育全能性（或多能性）的細胞。近年來，干細胞研究領域不斷有所突破，1999年發現了成體干細胞具有跨系跨胚層分化的“可塑性”；尤其值得一提的是，最近由體細胞獲得的誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPS細胞）具有和ES細胞幾乎一樣的生物學特性，進一步推動了全世界干細胞研究的熱潮。

一、ES細胞的生物學特性和研究價值

一方面，ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形態結構，細胞體積小，核大，核質比高，有一個或多個核仁，核型正常，具有整倍性。ES細胞體外培養時呈鳥巢集落狀生長，細胞緊密堆積，難以看清細胞輪廓，集落邊界清晰，有立體感。

另一方面，ES細胞還具有細胞系的特征，可以在體外長期傳代、冷凍保存、核移植和遺傳操作等。ES細胞在功能上的主要特征就是無限自我更新和高度的分化潛能。

一般來講，細胞多能性檢測的方法主要有：①體外懸滴培養誘導形成類胚體實驗，即將ES細胞培養在不含分化抑制物的培養基上，可以形成類胚體（embryoid bodies，EB）。②體外特定條件下誘導分化成任一胚層細胞實驗，將ES細胞在特定培養基進行培養，定向分化成任一胚層的特定組織。③體內皮下畸胎瘤實驗，將ES細胞懸液注射入同源動物皮下，形成組織瘤，包含三胚層細胞的混雜細胞群體。④體內胚胎嵌合種系傳遞實驗，將ES細胞與胚胎細胞共同培養或者將ES細胞注射入囊胚腔中，ES細胞就會參與多種組織發育。ES細胞多能性檢測還可以對維持細胞多能性相關的重要轉錄因子（Oct4、Sox2、Nanog等）進行檢測或者對ES細胞的相關蛋白分子標記物檢測。

ES細胞的分離培養建系是胚胎生物技術領域的重大成就，同時也是現代生物技術研究的熱點和焦點，ES細胞特有的生物學特性，決定了其在生物學領域有著不可估量的應用價值。基礎方面主要應用于研究基因功能、細胞分化和個體發育，應用方面主要是作為組織工程中重要的種子細胞用于損傷和疾病組織的修復和替代治療研究。同時，它在藥理和毒理研究方面也具有重要作用；對于動物生產而言，在核移植、嵌合體、轉基因動物研究方面也進行了廣泛的嘗試，已經充分體現出ES細胞在加快良種家畜繁育、生產轉基因動物、建立哺乳動物發育模型、基因和細胞治療等方面有著廣闊的應用前景。

二、ES細胞的最新進展：iPS細胞

iPS細胞是將維持ES細胞多能性相關的一些核心基因（Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，Nanog和Lin28等）轉導入非多能性的細胞（各種終末分化的體細胞或者成體干細胞）后產生的類似多能性ES細胞的特殊細胞類型（圖1）。為了提高iPS細胞技術的效率及安全性，研究圍繞著篩選標記、載體系統、轉導基因的種類、體細胞類型和一些可以促進效率提高的化合物篩選等展開，目前進展很快。iPS細胞在不斷朝著簡便、高效和安全的方向快速發展，與ES細胞的方向一樣，iPS細胞的誘導分化及其可能的生物醫學研究也在不斷拓展。

iPS細胞的產生證實了分化的細胞可以通過少數幾個因子的外源導入而被重編程到多能狀態，為進一步研究多能性的調控機制提供了新的研究模型，這種全新的體細胞核重編程的方法在基礎研究和臨床應用方面具有極其重大的意義。盡管制造iPS細胞的方法近來不斷優化，但目前對iPS細胞產生的具體分子機制還不十分清楚。同時，這種方法重編程的效率依然較低，雖然已有一些動物實驗初步顯示了iPS細胞的臨床潛能，但是安全問題依然有待評估，所以iPS細胞應用于臨床尚待時日，尤其是要深化對iPS細胞產生機理的研究。

圖1 iPS細胞技術簡圖

三、ES細胞研究的重點領域

1.ES細胞的分離培養建系。通過完善ES細胞的分離、培養、擴增、鑒定和冷凍保存技術來研究不同物種、不同方法的ES細胞建系的效率和質量，進一步嚴格規范ES細胞標準，提高不同ES細胞的同質性。

2.ES細胞自我更新的分子機制。通過對ES細胞全能性維持和調節研究來闡明ES細胞自我更新的分子機制，這主要是通過細胞內外的相關細胞信號通路來實現的，是研究ES細胞干性及分化的基礎。

3.ES細胞誘導分化及其機制。研究ES細胞向一些重要組織的祖細胞或者終末分化細胞誘導分化，提高誘導分化的效率和分化后細胞的純化。

4.iPS細胞的建立及其與ES細胞關系。通過對不同物種不同組織的細胞進行誘導重編程，進一步研究重編程的機理，并且比較iPS細胞與ES細胞的異同。

5.細胞多能性的獲取及其表觀遺傳學機制。

體細胞重編程從而重新獲得多能性的過程是一個表觀遺傳學的過程，通過對體細胞克隆、細胞融合以及iPS細胞的研究可以揭示其中的表觀遺傳學機理。

四、ES細胞研究面臨的主要問題

首先就是不同物種甚至不同品系的建系效率和質量有較大的差異，這其中的原因還沒有充分研究清楚，從而導致一些物種的ES細胞不能建立或者說研究結果穩定性較差。第二是ES細胞維持多能性無限增殖和誘導分化的分子機制有待于進一步闡明。第三是各種誘導分化策略技術體系還不完善和成熟，尤其是誘導分化后靶細胞的分離純化方法和效果還需要不斷研究。第四就是ES細胞容易導致畸胎瘤的出現，所以其應用的安全性問題一直備受關注，這也是ES細胞應用最為迫切需要解決的一個問題。第五就是由于ES細胞來源涉及早期胚胎，對人而言，面臨著諸多倫理、道德和法律等方面的爭議。第六是ES細胞作為再生醫學最重要的種子細胞，盡管擁有很大的優勢，但是作為一種異源細胞，免疫排斥的問題尚未很好解決。最后，在ES細胞的培養體系中，由飼養層、血清、動物源性成分導致的培養成分不明和可能的交叉污染也是近年來ES細胞研究中的一個熱點問題。