microRNA在現代中醫藥研究中的作用和意義1）

鄭思道，吳紅金，劉宇娜

MicroRNA（miRNA）是一種長約22個核苷酸的單鏈小分子RNA，本身不編碼蛋白質，但能夠在轉錄后水平調控靶基因表達，調節細胞功能，屬于表觀遺傳學范疇［1］。人體大約有1 000余種miRNA，這些miRNA可以調控20%～30%的基因表達，從而調節人體生長、發育、生理和病理等過程［2］。對miRNA表達譜的分析可以用于發現新生物標志物，而對miRNA干擾技術的研究則能夠用于發現藥物干預作用的新靶點、新途徑和新機制［3－5］。

基于miRNA研究技術的完善和成熟，中藥治療作用的miRNA機制研究將會逐漸獲得關注。綜合相關研究，本文在分析目前中藥及其活性成分調節miRNA研究的基礎上，對miRNA在中醫藥現代研究的作用和意義進行探討。

1 miRNA的發現、理論形成和研究方法

miRNA由Lee研究小組于1993年對秀麗隱桿線蟲的研究中首次發現［6］。隨后的研究進一步發現在果蠅、蠕蟲和人類體內也存在miRNA，該類分子可以與靶基因3’非編碼區（3’－Untranslated Region，3’－UTR）結合，下調靶基因表達水平［7］。在對miRNA的研究過程中逐漸形成了其對基因表達調控的經典學說：由內含子或多順反子轉錄本首先轉錄出初級miRNA，經RNA酶Drosha處理后，形成70～100核苷酸的莖環結構樣miRNA前體，然后被輸出蛋白5從細胞核轉運至細胞質，最終被Dicer酶切成成熟的miRNA鏈和與其互補的miRNA＊鏈，互補鏈很快降解，而成熟的miRNA則與RNA介導的沉默復合物結合，通過抑制靶mRNA翻譯或促進其降解下調基因表達［8］。

盡管miRNA對基因的調節作用和方式不完全相同，近年來逐漸形成了miRNA研究的通用模式。Evavan Rooij對此進行了總結，首先進行miRNA表達篩選，主要應用miRNA芯片篩選、深度測序、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Quantitative Real－Time Polymerase Chain Reaction，qRT－PCR）、RNA印跡和原位雜交等技術；其次對miRNA靶基因進行確證，主要應用生物信息分析、UTR分析、轉錄組／蛋白組分析和pull－down研究等技術；最后進行miRNA干預研究，主要應用離體miRNA調節、基因miRNA調節、在體miRNA抑制和在體miRNA模擬等技術［8］。

2 中藥及其活性成分對miRNA的調節作用

2.1 對腫瘤相關miRNA的調節 miR－15a和miR－16姜黃素（Curcumin）是姜黃中的一種多元酚，可以與組蛋白脫乙酰酶、組蛋白乙酰轉移酶、DNA甲基轉移酶1和miRNA結合，具有調節表觀遺傳信息的作用［9］。有研究表明，姜黃素可以通過miR－15a和miR－16介導對Bcl－2的調控，顯示出抗腫瘤作用：在姜黃素處理的人乳腺癌MCF－7細胞中miR－15a和miR－16表達上調，Bcl－2表達下調；應用抑制劑下調miR－15a和miR－16表達水平時，Bcl－2的表達恢復［10］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin Gallate）是綠茶多酚的主要活性成分之一，研究顯示該分子能夠上調肝細胞癌HepG2細胞中13個miRNA、下調48個miRNA，其中被上調的miR－16可以通過抑制靶基因Bcl－2表達介導細胞凋亡，顯示抗腫瘤作用［11］。2.1.1 miR－21和miR－200 吉西他濱治療胰腺癌的藥物敏感性可以被姜黃素或其類似物調節，這一作用由上調的miR－200和下調的miR－21介導：miR－21的下調引起第十號染色體同源缺失性磷酸酶－張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome Ten，PTEN）表達的增加，而PTEN是抑癌基因之一；miR－200的上調則介導藥物治療敏感性的增強［12］。近期研究證實，姜黃素呈劑量依賴性抑制激活蛋白1（activator protein 1，AP－1）與 miR－21轉錄啟動子的結合，降低miR－21的轉錄，進而提高其靶基因程序性細胞死亡因子4（programmed cell Death 4，PDCD4）的表達水平，促進細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用［13］。中藥王不留行的活性單體鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl Phthalate，DBP）也具有下調miR－21表達的作用：對泌乳中期奶牛乳腺上皮細胞中miRNA的調節作用與催乳素類似，均能下調miR－125、miR－143和miR－195的表水平，不同的是DBP對miR－21的表達具有明顯抑制作用，而催乳素對miR－21的影響尚不明確［14］。大豆異黃酮（Isoflavone）是大豆中的一種黃酮類化合物，與雌激素有相似結構中，具有抗腫瘤作用［15］。研究顯示，大豆異黃酮能夠通過上調miR－200抑制胰腺癌細胞中轉錄因子ZEB1、Slug基因和波形蛋白的表達，逆轉上皮－間質轉分化的表型改變，表明大豆異黃酮對miRNA的調節可能是其抗腫瘤的作用機制之一［16］。

2.1.2 miR－22 除miR－21和 miR－200以外，姜黃素也能夠上調胰腺細胞中miR－22表達水平，并下調miR－199a＊，其中miR－22的上調可以抑制胰腺癌PxBC－3細胞中的靶基因轉錄因子SP1和雌激素受體1表達，表明miR－22也介導了姜黃素的抗腫瘤作用［17］。

2.1.3 mi－128 人參皂苷（Ginsenoside，GSS）是人參的主要活性成分，現代研究表明人參具有抗腫瘤作用［18］。GSS Rh2（R型）能夠調節膠質瘤U251細胞中miRNA的表達（上調14個，下調12個），其中 miR－128在人膠質瘤 U251、T98MG和A172等三個細胞系中的上調被qRT－PCR進一步證實；而miR－128表達下調則降低GSS Rh2介導的半胱氨酸天冬氨酸酶3（Cysteine－Aspartic Protease 3，caspase－3）激活水平和靶基因E2F3a的蛋白表達，抑制細胞毒性作用，減少細胞凋亡［19］。可以看出miR－128介導了GSS Rh2對癌細胞增殖的抑制作用。

2.1.4 miR－146a 胰腺癌的高侵襲性與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）過表達和核因子κB（Nuclear factorκB，NF－κB）的活化有關，伴有 miR－146a表達的下調；大豆異黃酮能夠通過上調miR－146a降低EGFR和白細胞介素1受體相關激酶（interleukin－1receptor－associated kinase 1，IRAK－1）的表達水平，而IRAK－1是NF－κB的調節酶，能夠調控其表達水平［20］。該研究表明miR－146a介導的EGFR和NF－κB表達抑制，是大豆異黃酮拮抗胰腺癌細胞侵襲和轉移的作用機制之一。白藜蘆醇（Resveratrol）是虎杖的根莖提取物之一，也存在于某些葡萄的果皮中，被證實具有抗腫瘤作用［21］。較早的一篇研究表明，NF－κB敏感的miR－146a與補體因子 H（Complement Factor H，CFH）的3’－UTR互補，兩者結合后下調CFH表達，增強阿爾茨海默癥患者腦組織的炎癥反應，而白藜蘆醇可以抑制miR－146a的表達，減輕炎癥反應［22］。

2.1.5 miR－186 姜黃素能夠通過下調耐順鉑人肺腺癌A549／DDP細胞株的miR－186表達水平加速細胞凋亡；轉染miR－186的類似物后，miR－186的表達上調，細胞凋亡減少，這一結果表明姜黃素可以通過下調miR－186促進細胞凋亡，是其治療腫瘤的作用機制之一［23］。該課題組的另一研究顯示，caspase－10可能是 miR－186的靶基因［24］。

2.1.6 miR－663 研究顯示，白藜蘆醇能夠上調人單核細胞白血病的miR－663表達水平，并通過其靶基因JunB和JunD下調AP－1表達，表明miR－663在白藜蘆醇的抗腫瘤機制中具有重要作用［25］。該課題組的另一研究也證實，白藜蘆醇能夠上調miR－633的表達，并下調靶基因轉化生長因子－β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）的表達水平，兩者結合位點在TGFβ1mRNA的3’－UTR［26］。該研究同時顯示，白藜蘆醇可以下調腸癌SW480細胞中腫瘤相關的其他miRNA，這些miRNA涉及對Dicer1、PDCD4和PTEN等的調節。2.1.7 其他miRNA 研究顯示，延胡索中的延胡索總生物堿對人肝癌HepG2細胞中的miRNA具有調節用，與抑制腫瘤增殖作用相關的miRNA包括下調的miR－221、miR－222和上調的miRNA let－7a［27］。另一對中藥復方的研究顯示，鼻咽癌細胞的增殖可以被復方小柴胡湯（半枝蓮、莪術、法夏）抑制，其作用機制涉及對miR－513、miR－498、miR－210miR－602的調節［28］。

2.2 對心血管疾病相關miRNA的調節

2.2.1 miR－1 丹參酮ⅡA（Tanshinone，ⅡA）是中藥丹參的活性成分之一，具有保護心肌和抗缺血性心律失常的功效［29，30］。楊寶峰等［31］對丹參酮抗缺血性心律失常的 miRNA機制進行了研究，結果顯示，下調miR－1、升高Kir2.1可能是丹參酮ⅡA治療缺血性心律失常的作用機制之一。進一步實驗表明，丹參酮ⅡA也可以抑制缺血及低氧條件下（98%N2＋2%O2）心肌細胞中p38絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen－Activated Protein Kinase，MAPK）介導的miR－1上調，逆轉其對縫隙連接蛋白43翻譯的抑制，從而保護缺血心肌［32］。

2.2.2 miR－21和miR－539 白藜蘆醇對缺血性心臟具有保護作用，涉及對心肌細胞多個miRNA的調節作用，其中的miR－21參與胞外信號調節激酶－ MAPK信號通路的調節，與心肌纖維化密切相關；miR－539則通過靶基因包括基質金屬肽酶20、成纖維細胞生長因子14、網格蛋白、輕鏈多肽、骨保護素、轉錄因子類似物叉頭框B1等參與調節心肌重構［33］。

2.2.3 miR－214 GSS Rg1可以調控人臍靜脈內皮細胞22個miRNA的表達水平，其中下調的miR－214被進一步qRTPCR證實，其靶基因是內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），結合靶點位于eNOS mRNA 的3’－UTR，因而GSS Rg1通過miR－214的介導最終顯示出上調eNOS表達的作用，有利于促進血管的生成［34］。

2.3 對代謝性疾病miRNA的調節

2.3.1 miR－34a 孫維峰等［35］應用qRT－PCR芯片進行的研究表明，泄濁除痹方（土茯苓、萆薢、山慈菇、王不留行、牛膝）能夠調節腎臟組織的miRNA表達（上調5個，下調27個），改善高尿酸血癥。在被調節的miRNA中miR－34b－5p上調幅度最大，而miR－208下調幅度最大；該方呈劑量依賴性下調miR－122和上調miR－34a、miR－146，靶基因預測顯示，miR－34a的靶基因是尿酸轉運子（urate transporter 1，URAT－1），進一步細胞轉染mi－34a類似物的研究證實，miR－34a能夠抑制URAT－1的表達。

對上述研究綜合分析發現，中藥活性成分可以特異性調節單個miRNA表達，也有可能同時調節多個miRNA表達；特定miRNA的表達也可以被多種中藥活性成分調節（見表1）。

表1 中藥及其活性成分對miRNA的調節作用

3 中藥相關miRNA的研究意義

3.1 闡明中藥作用機制 中藥及其活性成分對miRNA具有廣泛調節作用，而miRNA對人體生理病理過程中具有重要調控作用。可以推測miRNA介導的治療作用是中藥取效的新機制之一，miRNA研究為中藥作用機制的探索開辟了全新領域。主要體現在可以通過miRNA表達譜、靶基因分析和miRNA干擾等技術確定中藥及其活性成分的人體miRNA靶標，闡明特定中藥或中藥活性成分對人體特異miRNA的調節作用，進而探索靶基因的調控作用和細胞功能，最終詳細繪制出中藥／中藥活性成分－miRNA－mNRA－蛋白質－細胞功能－疾病治療的完成路線圖。這種方法不僅可以對單個分子層面進行研究，也可以結合信息分析和實驗驗證等多種技術分析多層面分子之間的聯系，促進中藥作用機制研究的系統化、網絡化和整體化。更進一步的研究可以將miRNA研究技術與中藥化學物質組、基因組、蛋白質組和代謝組學等研究方法結合起來，應用系統生物學的理念探索中藥的網絡靶標和調節通路［36，37］。

另外，研究表明植物也含有miRNA，這些miRNA的結構與人體miRNA相似但不完全相同，然而一些miRNA可以通過消化系統進入人體，調控組織細胞功能［38］。這一發現提示miRNA也是中藥的活性成分之一，并且不同于以往中藥或中藥活性成分進入人體調節其他分子的作用機制，中藥miRNA可以直接調節人體miRNA表達。無論是miRNA直接調節人體miRNA表達，還是中藥其他分進入人體后間接調節miRNA表達，對中藥及其活性成分miRNA調節作用的探索將極大推動中藥作用機制研究。

3.2 創新傳統中藥新藥研發 miRNA干擾技術不僅可以用于發病機制和藥物作用機制研究，還可以作為研發新藥的新途徑。miRNA的類似物或拮抗劑可以通過調節特異性miRNA表達調控靶基因并最終影響細胞功能、干預疾病進程［39，40］。中藥屬天然藥物，其活性成分也為自然存在，毒副反應發生率低，具有較好的人體相容性。提取活性成分或應用自身含有的miRNA進行人體miRNA干預研究可以增加中藥新藥研發的成功率，并顯著降低研發成本和風險，是中藥新藥研發的優選途徑之一。3.3 擴展現代中醫藥理論 隨著研究方法的改進和研究領域的擴展，中醫藥理論也不斷豐富。miRNA的發現為現代中醫藥理論的發展提供了新的切入點。miRNA具有組織特異性［41］，是否可以結合歸經理論探索中藥的靶向作用？miRNA也顯示出疾病特異性［42］，結合中醫辨證、辨病的特點，能否對中醫病證的表象和本質進行分析？miRNA可以調節多個靶基因［43］，而中醫藥療疾治病具有整體觀，兩者的特性是否存在聯系？這些是中醫藥miRNA相關研究中值得關注的諸多問題中的一小部分，這類思考和探索將有助于促進中醫、中西醫結合理論的發展。

在中醫理論指導下對中醫藥miRNA相關進行研究，對闡明中藥作用機制、創新中藥新藥研發和豐富現代中醫理論具有重要意義，值得深入探索和分析。

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