醋制南五味子抗α－淀粉酶活性部位篩選＊

蒙躍龍 董彬廠 鄧 翀 陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（咸陽(yáng)712046）

南五味子為木蘭科華中南五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的果實(shí)，有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的作用。炮制方法主要有醋制、酒制、蜜制、炒制、蒸制等。生品以斂肺止咳為主，用于自汗盜汗，口干作渴；醋制后增強(qiáng)酸澀收斂之性。近幾年文獻(xiàn)報(bào)道五味子具有抗糖尿病的生理活性。西方醫(yī)學(xué)通過(guò)化學(xué)合成法尋找α－淀粉酶抑制劑取得了一定進(jìn)展，但合成藥物對(duì)糖尿病患者的耐藥性與副作用也日益明顯，尋找安全、有效的天然α－淀粉酶抑制已被提上日程。本研究采用酶法測(cè)定南五味子炮制前后不同化學(xué)部位對(duì)α－淀粉酶抑制活性，為五味子輔助降糖新藥研發(fā)提供一定的依據(jù)。

1 試藥和儀器

1.1 藥材 南五味子購(gòu)于陜西南鄭縣，經(jīng)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為木蘭科華中南五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的成熟果實(shí)。

1.2 試劑試液 α－淀粉酶（北京奧博星生物技術(shù)有限公司，20120205）；可溶性淀粉（天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110308）；阿卡波糖（天津西瑪科技有限公司，批號(hào)20120301）；3，5－二硝基水楊酸（上海科豐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20101009）3，5－二硝基水楊酸試液（取3，5－二硝基水楊酸6.5g加入325mL的2mol·L－1氫氧化鈉和45mL丙三醇，再加入蒸餾水至1000mL，充分溶解，室溫存放備用）；0.2mol·L－1PH＝5.6檸檬酸緩沖溶液、0.12mol·L－1PH＝6.1磷酸鹽緩沖溶液，其它試劑均為分析純。

1.3 儀器 UV1102型紫外可見分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)A2004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）PHS－3C型雷磁精密PH計(jì)。

2 方 法

2.1 南五味子各提部位的制備 稱取炮制前后南五味子藥粉各10g，分別以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水10倍量溶劑各提取兩次，每次1h，合并各溶劑濾液并蒸干。氯仿和乙酸乙酯提取部位均用無(wú)水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移置25mL量瓶中定容；正丁醇提取部位用80%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移置25mL量瓶中定容（將定容后的炮制前后正丁醇提取部位溶液稀釋十倍再進(jìn)行測(cè)定）；水提取部位用蒸餾水溶解轉(zhuǎn)移置100mL量瓶中定容，將制備好的各樣品提取部位溶液密封4℃冷藏放置，待用。

2.2 α－淀粉酶活性的測(cè)定原理 采用3，5－二硝基水楊酸方法（3、5－dinitrosalicylic acid、colorimetric assays，Bernfeld method）測(cè)定α－淀粉酶活性，Bernfeld法是通過(guò)確定可溶性淀粉在α－淀粉酶作用下水解產(chǎn)生的還原基團(tuán)將3，5－二硝基水楊酸還原為硝基氨基水楊酸（棕紅色物質(zhì)），還原基團(tuán)的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺程度成一定的比例關(guān)系，在波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定棕紅色物質(zhì)和陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的吸光值（A）[1]，由于α－淀粉酶抑制劑對(duì)淀粉水解有抑制作用，可使A520值下降，從而可以計(jì)算待測(cè)物對(duì)淀粉酶活性的抑制率。

2.3 南五味子各提取部位抑制α－淀粉酶活性的測(cè)定方法 設(shè)α－淀粉酶管、各不同提取部位管、陽(yáng)性對(duì)照管、α－淀粉酶空白對(duì)照管、各提取部位空白對(duì)照管、陽(yáng)性對(duì)照空白管。炮制前后各提取部位管中加入0.4mL提取液揮干溶劑并加0.4mL磷酸鹽緩沖溶液溶解后，加入0.4mL檸檬酸緩沖液、0.8mL 8mg·mL－1淀粉溶液[2]（用檸檬酸緩沖溶液配制）、2mL 4mg·mL－1α－淀粉酶液[3]，總反應(yīng)體積為3.6mL。

將各管內(nèi)溶液混勻，37℃水浴保溫30min后，分別加入6mL 3，5－二硝基水楊酸溶液，搖勻，置于100℃水浴保溫10min，冷卻置室溫，分別取各管反應(yīng)液1mL加入9mL蒸餾水于520nm處檢測(cè)吸光度值（A）。

α－淀粉酶抑制率計(jì)算公式如下：

3 結(jié) 果 南五味子炮制前藥材中乙酸乙酯提取部位的抑制作用最強(qiáng)，其次為氯仿和正丁醇提取部位，水提取部位的抑制作用最弱。炮制后藥材中乙酸乙酯提取部位的抑制作用最強(qiáng)，其次為正丁醇和氯仿提取部位，水提取部位抑制作用最弱。南五味子醋制后各化學(xué)部位抗α－淀粉酶活性強(qiáng)于其炮制前對(duì)應(yīng)各化學(xué)部位。

表1 炮制前后南五味子提取部位對(duì)α－淀粉酶抑制率（n＝5）

4 討 論 α－淀粉酶抑制劑能有效抑制唾液和胰液α－淀粉酶活性，阻礙食物中碳水化合物的分解和消化，減少葡萄糖產(chǎn)生和攝取，從而可以有效防止糖尿病和高血脂癥。因此，α－淀粉酶抑制劑常被用于治療II型糖尿病，可有效降低餐后血糖水平和減少糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[4]。

α－淀粉酶由于受溫度和PH的影響很大故應(yīng)使用前配制，可溶性淀粉的溶解性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，故應(yīng)先將0.2mol·L－1檸檬酸鹽緩沖溶液加熱到100℃加入可溶性淀粉，攪拌，使之迅速溶解，冷卻至室溫再用檸檬酸緩沖液調(diào)至所需濃度。為了保持各待測(cè)組的平行，應(yīng)將淀粉溶液最后加入。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中南五味子炮制前后乙酸乙酯提取部位對(duì)α－淀粉酶活性抑制作用最強(qiáng)，而正丁醇部位在炮制前后抑酶率變化較大。南五味子炮制后各部位抗α－淀粉酶活性強(qiáng)于其炮制前各部位。南五味子炮制前后各化學(xué)部位抗α－淀粉酶活性比較可知，氯仿、乙酸乙酯、正丁醇化學(xué)部位抗α－淀粉酶活性明顯。

[1]B.施特爾巴赫著，錢喜淵譯.酶的測(cè)定方法[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1992：37－41.

[2]趙修南，賈啟燕，單俊杰.α－淀粉酶抑制劑篩選方法的優(yōu)選[J].2008，35（5）：321－324.

[3]吳慧平，陳建偉，許婷婷，等.骨碎補(bǔ)與夜交藤組合物對(duì)α－糖苷酶活性的影響[J].2012，18（5）：181－184.

[4]徐林峰，沈忠明，殷建偉，等.五味子中提取α－ 葡萄糖苷酶抑制劑的研究[J].中國(guó)生化藥物雜志，2001，22（3）：127.