解毒灌腸液干預肝硬化家兔內毒素血癥的實驗研究＊

馬羽萍 張殿增 張新昀 劉 莉 趙 玲 彭 杰 黃小正 郭雅玲

陜西省傳染病院（西安710061）

腸源性內毒素血癥，在臨床疾病的發生發展過程中起著非常重要的作用[1]。腸源性內毒素血癥可引起肝臟持續性損害，是加速和促使肝硬化形成的原因之一，也是促使肝硬化并發癥形成的重要原因，嚴重影響肝硬化患者的生存及預后[2]。肝硬化患者腸源性內毒素血癥的發生率較高。前期我們通過運用復方中藥解毒灌腸液治療重型肝炎和肝硬化患者合并內毒素血癥的臨床研究，發現該方藥能改善臨床癥狀，降低內毒素，改善肝功能，減少并發癥[3]。本研究通過家兔肝硬化模型動物造模，觀察復方中藥解毒灌腸液對其血液內毒素水平、肝組織炎性細胞因子、病理切片變化及肝腎功能的影響，探討該方藥對內毒素血癥動物的保護作用。

1 實驗材料

1.1 解毒灌腸液 大黃1500g，金銀花、蒲公英、丹參、赤芍、白頭翁各1000g，枳實、厚樸各500g。制成濃縮煎液（比重為1.04—1.05），高壓滅菌，分裝（200mL/瓶）。本制劑所用藥材的生藥鑒定均按照中國藥典2000版一部有關的各項規定進行。

1.2 試劑 內毒素脂多糖（LPS），Sigma Chemical Co.產品（批號L2880。抗兔內毒素（批號：2011111033）和抗兔TNF－α（批號：20111109046）Elisa試劑盒均購自天津索羅門生物科技有限公司。頭孢克肟片為江蘇正大清江制藥有限公司生產，乳果糖為安維世制藥（北京）有限公司生產。四氯化碳為廣東光華化學廠有限公司產品（批號：20091015），用時以高壓消毒過的色拉油配制成50%的溶液。生化檢測在西安交通大學第一附屬醫院臨床檢驗中心進行。

1.3 動物 SPF級健康雄性家兔，6月齡，體重1.9±0.5kg，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，在層疊式自動沖水不銹鋼籠內飼養，供自來水和兔標準顆粒飼料，自由攝食飲水。

2 方法 取SPF級健康雄性家兔42只，適應性喂養1周后，耳中動脈采血后，所有動物以0.1mL/㎏劑量用一次性注射器腹腔注射四氯化碳。每3d1次，連續90d。肝硬化造模結束后，將存活的40只動物隨機分為四組：3個對照組，即生理鹽水、乳果糖、頭孢克肟灌腸組；1個實驗組，即解毒灌腸液灌腸組。于注射四氯化碳結束前兩周分別用生理鹽水、乳果糖、頭孢克肟和解毒灌腸液進行保留灌腸，容積為10mL/只，每日1次；灌腸結束12h后，用內毒素LPS灌胃（40μg/kg）1次，持續2周。末次LPS灌胃2h后，心臟采血，測定肝腎功能相關的生化指標、血液學指標、血液內毒素水平和TNF－α水平。然后脫臼處死動物，摘取心、肝、脾、腎和大腦稱濕重，計算臟體比。摘取大腸，稱濕重后在105℃烤箱內烘干，稱干重，計算其干濕比。最后將心、肝、脾、腎和大腸標本用10%甲醛固定，常規切片，進行病理學檢查。

3 結果

3.1 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔肝腎功能的影響于造模前和內毒素灌胃后分別于耳中動脈和心臟采血，用全自動生化檢測儀檢測動物的血液生化學指標，結果如表1示。

表1 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔肝腎功能的影響（±s）

表1 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔肝腎功能的影響（±s）

與生理鹽水組比較，△P＜0.05，＊P＜0.05，△△P＜0.05；與乳果糖組比較，＊＊P＜0.05；與頭孢克肟組比較，＃P＜0.05。

生理鹽水組 乳果糖組 頭孢克肟組 解毒灌腸液組AST（U/L） 10 92.77±34.51 79.77±40.97 91.05±35.85 59.13±12.38△△＃組別/項目 n 10 2.79±1.02 2.57±0.78 2.86±1.02 3.18±0.81 ALT（U/L） 10 95.15±24.88 102.45±57.28 92.17±18.23 58.43±11.10△△＊＊＃ALP（U/L） 10 159.90±27.79 102.12±55.67△ 99.07±57.35 57.42±6.54△△＊＊＃CHOL（mM/L） 10 4.77±2.12 5.04±2.43 5.82±2.38 4.23±2.25△△TP（g/L） 10 61.93±5.28 62.15±5.57 61.95±5.53 66.50±1.30△△＊＊＃ALB（g/L） 10 34.60±3.84 35.07±4.43 34.85±4.22 38.38±1.43△△＊＊＃BUN（mM/L） 10 12.43±4.04 6.27±1.38 6.12±1.57 5.52±1.10△△CREA（μM/L） 10 155.28±33.34 77.75±8.17△ 72.30±6.37＊ 72.30±6.25△△TG（mM/L）

表1中的結果表明，與生理鹽水組比較，乳果糖組中肝、腎功能多指標明顯改善，解毒灌腸液組中肝、腎功能指標普遍較對照組明顯改善。

表2 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔血液學的影響±s）

表2 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔血液學的影響±s）

與生理鹽水組比較，各組血常規指標無明顯差異，P＞0.05；與頭孢克肟組比較，＃P＜0.05。

生理鹽水組 乳果糖組 頭孢克肟組 解毒灌腸液組RBC（1012/L）10 5.28±1.17 5.08±0.78 6.05±1.00 4.91±0.73組別/項目 n＃HGB（g/L） 10 117.83±16.68 119.33±16.52 130.0±12.20 114.00±13.97＃WBC（109/L）10 3.92±2.60 3.10±2.51 3.44±2.50 2.86±2.50 LYMP（%） 10 69.33±17.12 71.13±16.20 79.22±4.70 70.68±18.26 NEUT（%） 10 26.48±17.41 26.22±16.31 17.62±4.94 26.67±17.27

表2中的結果顯示，各組的血液學指標較模型對照組沒有明顯差別，說明給藥后模型動物的血液學指標沒有明顯的改變。

表3 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔血清TNF－α和ET水平的影響±s）

表3 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔血清TNF－α和ET水平的影響±s）

與生理鹽水組比較，△P＜0.05，＊P＜0.05，△△P＜0.05；解毒灌腸液組與乳果糖組及頭孢克肟組比較，＊＊P＜0.05，＃P＜0.05。

生理鹽水組 乳果糖組 頭孢克肟組 解毒灌腸液組TNF－α（ng） 10 424.27±87.25 313.26±65.64△ 315.68±45.73＊ 220.87±103.61＊＊△△＃組別/項目 n ET（pg/mL） 10 165.87±42.36 85.72±42.46△ 137.32±40.77 65.50±28.82△△＃

表3顯示，與生理鹽水組比較，各組動物血清TNF－α、ET水平明顯降低；與乳果糖組及頭孢克肟組比較，解毒灌腸液組動物血清TNF－α、ET水平降低更為明顯（P＜0.05）。

表4 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔臟體比的影響±s）

表4 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔臟體比的影響±s）

與生理鹽水組比較，各組動物臟體平均重量無明顯差異，P＞0.05；與乳果糖組比較，＊＊P＜0.05。

組別 n 體重臟體比心臟（g） 肝臟（g） 脾臟（g） 腎臟（g） 腦（g）7.20±1.41 3.20±0.61乳果糖組 10 2.32±.019 2.35±028 39.43±8.88 1.19±0.17 6.68±1.06 3.13±0.20頭孢克肟組 10 2.17±0.21 2.42±0.31 39.87±2.95 1.16±0.29 7.44±0.80 3.25±0.63解毒灌腸液組 10 2.28±0.19 2.34±0.30 37.83±2.76 1.03±0.16＊＊生理鹽水組 10 2.37±0.32 2.31±0.35 38.78±5.83 1.14±0.28 7.00±0.92 2.96±0.49

表4中的結果顯示，與生理鹽水組比較，各組動物臟體平均重量沒有明顯的差別（P＞0.05）。說明造模與給藥對動物的臟體平均重量沒有明顯的影響。

表5 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔大腸干濕比的影響（±s）

表5 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔大腸干濕比的影響（±s）

與生理鹽水組比較，△P＜0.05，＊P＜0.05，△△P＜0.05；解毒灌腸液組與乳果糖組比較，＊＊P＜0.05，與頭孢克肟組比較，＃P＜0.05。

10 2.37±0.32 62.58±6.66 7.05±0.52 0.11±0.02乳果糖組 10 2.32±.019 45.70±3.03△ 6.47±80.38 0.14±0.02△頭孢克肟組 10 2.17±0.21 44.95±3.80＊ 6.22±0.49＊ 0.13±0.01解毒灌腸液組 10 2.28±0.19 38.07±4.02△△＊＊＃ 6.46±0.41 0.17±0.01△△＊＊＃干濕比生理鹽水組組別 動物數（n） 體重（kg） 濕重（g） 干重（g）

表5中的結果顯示，與生理鹽水組比較，乳果糖組、頭孢克肟組及解毒灌腸液組動物大腸的干濕比值明顯增加（P＜0.05）；與乳果糖組、頭孢克肟組比較，解毒灌腸液組動物大腸的干濕比值增加更為明顯。說明解毒灌腸液對肝纖維化動物大腸具有更強的保護作用。

3.2 病理檢查

3.2.1 肝臟病理檢查 于LPS灌腸后2h，脫臼處死動物，剪取肝臟樣品，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規切片，在顯微鏡下觀察肝臟的病理變化，結果如圖1所示。

圖1 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔肝臟病理學的影響 結果顯示，模型對照組動物的肝細胞明顯水腫，肝竇明顯擴張。竇內枯否細胞明顯濁脹、變形、數量增多，匯管腫脹、變形，數量增多較明顯，可見明顯地條索狀纖維化增生，井可見中性粒細胞浸潤。乳果糖組、頭孢克肟組見有相同改變，但程度較輕，少量中性粒細胞浸潤。解毒灌腸液組僅見肝細胞明顯水腫，纖維化增生較少，中性粒細胞浸潤明顯少于模型對照組和其他給藥組。HE染色，×400。

3.2.2 大腸病理檢查 于LPS灌腸后2h，脫臼處死動物，剪取大腸樣品，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規切片，在顯微鏡下觀家兔大腸的病理變化，結果如圖2所示。

討 論 腸源性內毒素是肝功能衰竭發生、發展的主要原因。腸道堪稱是內毒素的最大儲庫。活動性肝病時常伴有門脈高壓性腸病，其主要表現為血管擴張、扭曲、形成交通支、通透性增加（門脈高壓性腸血管病），粘膜充血、水腫、糜爛、出血。加之部分病人伴隨的自身免疫性腸病和感染性腸病，這些均可增加腸粘膜通透性，有助于內毒素的吸收，增加內毒素的攝取，

圖2 解毒灌腸液對肝纖維化模型家兔大腸病理學的影響結果顯示，模型對照組動物的大腸粘膜的炎癥反應明顯，血管充血擴張，粘膜水腫，中性粒細胞浸潤。乳果糖組和頭孢克肟組亦有明顯炎癥反應。解毒灌腸組動物的大腸粘膜的炎癥反應明顯減輕，血管擴張和水腫都不明顯。

從而致使肝硬化患者血清中的ET水平明顯增加，肝臟和結腸、直腸出現明顯的炎癥反應，大腸濕重增加[4]。內毒素血癥綜合征、肝性腦病，及出血等[5]。常是肝衰竭繼發多臟器衰竭的始動因素。因此腫瘤壞死因子被視為內毒素所知肝臟病理生理過程的關鍵性促炎物質[6]。內毒素血癥，從腸道給藥，通過腸道粘膜吸收，使藥物直達病所[7]，減少腸源性內毒素產生和吸收，降低血漿內毒素水平，下調或抑制損傷性細胞因子的分泌，改善肝內微循環，減輕內毒素對肝細胞線粒體的損傷，恢復正常的肝臟能量代謝，是肝衰竭臨床治療的一條新的思路。

目前在臨床上常采用多種方法以降低血液內毒素，如內毒素吸附劑乳果糖和抗菌素[9]等，還用一些中藥進行灌腸。乳果糖可以①酸化腸腔，減少胺類吸收；②調節腸道菌群，抑制腸道嗜堿性有害細菌生成；③滲透性腹瀉作用，減少ET滯留在腸腔，促進腸蠕動，減少內毒素庫；④滅活內毒素；⑤阻止活化單核巨噬細胞釋放細胞因子，減輕免疫反應。這些作用可能是它減輕肝硬化內毒素血癥模型動物肝臟損壞的原因，但它對腸粘膜沒有保護作用，對已經吸收的內毒素沒有清除作用。頭孢克肟則是通過殺滅腸道和吸收入血的活菌降低血液內毒素水平，對已經形成的LPS沒有作用。所以，它們對血液ET水平和TNF－α有一定的影響。

本研究結果顯示，造模形成的肝硬化內毒素血癥模型，生理鹽水組比對照組動物的肝腎功出現明顯的異常，血脂代謝失調，血清TNF－α、ET水平明顯提高，大腸的干濕比明顯減少，肝臟和大腸出現明顯的炎癥病理學改變。經藥物干預，乳果糖組和頭孢克肟組動物的這些改變有些減輕，但不是很明顯。解毒灌腸液組對動物肝纖維化模型家兔肝腎功能及血清TNF－α、ET水平的影響明顯（P＜0.05），大腸的干濕比、肝臟和大腸炎癥病理學改變與其他給藥組比較明顯。

解毒灌腸液由清熱解毒、通里攻下、活血化瘀的中草藥組成，對肝硬化內毒素血癥的家兔有顯著的保護作用，其途徑可能通過保護腸道屏障作用，改善微循環，減少腸道內毒素的吸收，降低機體的內毒素水平，從而減少炎性因子的產生，阻斷內毒素血癥的生物學效應。是治療肝硬化有效的輔助方法之一。

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