HPLC 法同時(shí)測(cè)定復(fù)方克霉唑乳膏中2 種成分的含量

柳 杰，陳艷偉，辛翠群，王春富*

復(fù)方克霉唑乳膏為我院制劑，由克霉唑和丙酸氯倍他索加適量基質(zhì)制成。復(fù)方克霉唑乳膏屬于抗真菌藥，皮膚科主要用于治療皮膚癬病、急慢性濕疹、脂溢性皮炎等皮膚病。為了有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者通過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)［1-4］，摸索實(shí)驗(yàn)條件，建立了同時(shí)測(cè)定制劑中克霉唑和丙酸氯倍他索含量的高效液相色譜方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津LC-2010C HT 高效液相色譜儀，伊利特Hypersil BDS-C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，UV Detector 檢測(cè)器，LC Solution工作站;賽多利斯儀器(北京)有限公司萬(wàn)分之一分析天平;DelTA320PH 計(jì);SK-1 快速型混勻器;HH-W420 數(shù)顯三用恒溫水箱;津騰溶液過(guò)濾器。

1.2試藥克霉唑?qū)φ掌?批號(hào):100037-200306)，丙酸氯倍他索對(duì)照品(批號(hào):100302-200602)，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;復(fù)方克霉唑乳膏(克霉唑30 mg/g，丙酸氯倍他索0.5 mg/g)，大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室，批號(hào):20110807、20110808、20110809;克霉唑，廣州市漢普醫(yī)藥有限公司，批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H44022613;丙酸氯倍他索，天津天藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):NCBP100902;乳膏基質(zhì)，天津市天驕制藥有限公司，批號(hào):2011502;蒸餾水，自制蒸餾水，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò);磷酸二氫鉀(分析純)，沈陽(yáng)市新西試劑廠，批號(hào):20070520;磷酸(分析純)，天津市化學(xué)試劑六廠，批號(hào):840404;甲醇(色譜純)，美國(guó)天地公司，批號(hào):1010910。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為伊利特Hypersil BDSC18柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm);流動(dòng)相為0.05 mol/mL磷酸二氫鉀溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.8)-甲醇-乙二胺(25∶75∶0.2);流速為0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量20 μL。理論塔板數(shù)克霉唑峰和丙酸氯倍他索峰均不低于5 000，克霉唑峰和丙酸氯倍他索峰的分離度大于2。

2.2 復(fù)方克霉唑乳膏的處方 克霉唑粉30 g;丙酸氯倍他索粉0.5 g;乳劑基質(zhì)加至1 000 g。

2.3 溶液的制備

2.3.1 流動(dòng)相溶液的制備 稱(chēng)取磷酸二氫鉀6.81 g，置于1 000 mL 容量瓶中，加水溶解定容至刻度，超聲5 min，用溶液過(guò)濾器過(guò)濾。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取克霉唑?qū)φ掌?2 mg 和丙酸氯倍他索對(duì)照品11 mg，分別置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為1.20 mg/mL 克霉唑儲(chǔ)備液和1.10 mg/mL丙酸氯倍他索儲(chǔ)備液。分別取3 mL 克霉唑儲(chǔ)備液和50 μL 丙酸氯倍他索儲(chǔ)備液，置于10 mL 容量瓶中，加入4.5 mL 甲醇，以水定容，即得克霉唑和丙酸氯倍他索濃度分別為360 μg/mL 和5.50 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取復(fù)方克霉唑乳膏1 g(約相當(dāng)于克霉唑30 mg 和丙酸氯倍他索0.5 mg)，置于100 mL 容量瓶中，加甲醇75 mL，置于70 ℃水浴中加熱5 min，時(shí)時(shí)振搖，取出后強(qiáng)烈振搖5 min，放至室溫，加水至接近容量瓶刻度線，放至室溫后以水定容，搖勻，置冰箱中冷藏2 h，取出后先搖勻，立即用孔徑0.2 μm 濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液放至室溫，取20 μL 進(jìn)樣。

2.3.4 空白溶液的制備 取空白乳膏基質(zhì)1 g，按“2.3.3”項(xiàng)下制備，取20 μL 進(jìn)樣。

2.4 干擾試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別取空白溶液、對(duì)照品溶液及供試品溶液適量進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果如圖1。各峰之間分離度良好，結(jié)果表明，空白基質(zhì)對(duì)克霉唑和丙酸氯倍他索測(cè)定無(wú)干擾。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3.2”項(xiàng)下方法配制的克霉唑和丙酸氯倍他索混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣5、10、20、30 和40 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，分別以克霉唑和丙酸氯倍他索的質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為縱坐標(biāo)，以峰面積(Y)為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，克霉唑和丙酸氯倍他索分別在90.0 ～720.0 μg/mL和1.38 ～11.0 μg/mL 濃度范圍線性關(guān)系良好，回歸方程分別為Y =1.28 ×10-4X-14.6(r =0.999 8)，Y =183 ×10-5X + 2.40 ×10-2(r=0.999 9)。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.3.2”項(xiàng)下方法配制的克霉唑和丙酸氯倍他索混合對(duì)照品溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果克霉唑和丙酸氯倍他索的RSD 分別為0.5% 和1.6%。表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液20 μL，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，分別于0、1、2、4 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果克霉唑和丙酸氯倍他索穩(wěn)定性RSD 分別為1.7%和0.2%。表明供試品溶液在4 h 內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 三種溶液的HPLC 圖譜

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份復(fù)方克霉唑乳膏，精密稱(chēng)取6 份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行平行測(cè)定。結(jié)果克霉唑和丙酸氯倍他索的重復(fù)性分別為0.6%和1.1%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取丙酸氯倍他索對(duì)照品25 mg，置于25 mL 容量瓶中，加適量甲醇溶解并稀釋至刻度，得1 mg/mL 丙酸氯倍他索對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取克霉唑?qū)φ掌?00 mg，置于100 mL容量瓶中，得3 mg/mL 克霉唑?qū)φ掌啡芤骸７Q(chēng)取9 份空白乳膏基質(zhì)約1 g，分別準(zhǔn)確加入濃度為1 mg/mL 丙酸氯倍他索對(duì)照品溶液各400、500、600 μL 和濃度為3 mg/mL 克霉唑?qū)φ掌啡芤焊?、10、12 mL，每種濃度各3 份，分別置于100 mL 容量瓶中，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算各自的回收率，結(jié)果如表1 所示。

表1 克霉唑和丙酸氯倍他索回收率試驗(yàn)

樣品含量測(cè)定:取3 批復(fù)方克霉唑乳膏，各取3 個(gè)樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品的含量測(cè)定

3 討論

在《中華人民共和國(guó)藥典》2010 年版二部中，克霉唑乳膏和丙酸氯倍他索均采用高效液相色譜法來(lái)進(jìn)行含量測(cè)定。但兩者的色譜條件各不相同，前者以甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(70∶30)(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH 值至5.7 ～5.8)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm;后者以甲醇-水(65∶35)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)則為240 nm。為了同時(shí)檢測(cè)復(fù)方克霉唑乳膏中的克霉唑和丙酸氯倍他索，筆者嘗試了以甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(70 ∶30)(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH 值至5.7)為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)在此條件下，克霉唑峰和丙酸氯倍他索峰不能與雜質(zhì)峰分離，而且克霉唑拖尾嚴(yán)重。經(jīng)過(guò)嘗試調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 值，發(fā)現(xiàn)pH 值越小，保留時(shí)間越短，并且，加入0.2%的乙二胺后，有效抑制了克霉唑拖尾。最終確立以0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(10%磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.8)-甲醇-乙二胺(25∶75∶0.2)為流動(dòng)相，克霉唑、丙酸氯倍他索與雜質(zhì)峰有效分離。由于樣品中丙酸氯倍他索含量較克霉唑少且響應(yīng)較低，為同時(shí)測(cè)定克霉唑和丙酸氯倍他索，選擇了丙酸氯倍他索有較強(qiáng)吸收的240 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本法測(cè)得復(fù)方克霉唑乳膏中克霉唑和丙酸氯倍他索的含量分別為標(biāo)示量的99.5%、98.2%，且操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，精密度高，可以同時(shí)測(cè)定復(fù)方克霉唑乳膏中的克霉唑和丙酸氯倍他索，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:102，320-321，580-581.

［2］ 王勇. HPLC 法測(cè)定復(fù)方克霉唑乳膏中二苯基-(2-氯苯基)甲醇和克霉唑的含量［J］. 中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010，11(3):227-230.

［3］ 胡守蓮，范玉峰.HPLC 法測(cè)定丙酸氯倍他索尿素乳膏中丙酸氯倍他索的含量［J］.藥品鑒定，2009，6(22):74-75.

［4］ 李亦蕾，鐘震邦，鄭萍，等.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方酮氯乳膏中酮康唑和丙酸氯倍他索的含量［J］. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29(9):1216-1218.