基質金屬蛋白酶－1 shRNA 真核表達載體的構建

朱秀麗，朱曉英，郭青玉，王 靜，溫德升，吳軍正

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)是涎腺最常見的惡性腫瘤之一，約占30%，易發生遠處轉移，主要發生在肺部。腫瘤細胞的轉移是惡性腫瘤的本質表現，MMP－1 是MMPs 家族中表達最高的降解纖維膠原的間質膠原酶，許多腫瘤組織中有MMP－1 的過表達，其表達與侵襲轉移及不良預后相關。本研究利用基因克隆技術構建人MMP1 RNA 干擾表達載體，并試驗性轉染人涎腺腺樣囊性癌高轉移性ACC－M 細胞株，驗證其對MMP1 的沉默作用，為進一步研究MMP1 對腫瘤細胞轉移的影響以及MMP1 特異性shRNA 真核表達載體的基因治療奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DNA Marker DL2000、T4 連接酶和限制性內切酶BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ(Takara 公司，日本);TOP10 大腸桿菌(第四軍醫大學口腔醫院口腔生物教研室保存);質粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒(Omega 公司，美國);LipofectamineTM2000 和Trizol(Invitrogen 公司，美國);RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit(MBI Fermentas 公司，立陶宛)，MMP－1 山羊抗人多克隆抗體(Santa Cruz 公司，美國);FITC 標記的山羊抗兔抗體(博士德，中國武漢);辣根過氧化物酶標記兔抗山羊IgG 和DAB顯色試劑盒(北京中杉公司);ECL 化學發光檢測試劑盒(Santa Cruz 公司，美國)。

1.2 質粒和細胞 pWH1 真核表達載體由第四軍醫大學生化教研室吳元明構建并惠贈，全長336 bp，具kana/neo 抗性。要表達的shRNA 插入到BglII 和HindIII 之間。人涎腺腺樣囊性癌細胞系ACC－2及其肺高轉移株ACC－M 由上海第二醫科大學附屬第九人民醫院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室建立并惠贈，常規培養于100 ml/L 胎牛血清的RPMI1640 培養液，置37 ℃，50 ml/L CO2培養箱中。

1.3 引物的設計與合成 以人MMP－1 cDNA 基因(Genebank ID:NM－002421)序列中的103－121核苷酸為標靶設計兩條引物，由上海Sangon 公司合成。序列為:P1:5'－GATCCCCTGTTCTGGGGTGTGGTGTCttcaagagaGACACCACACCCCAGAACATTTTTGG AAA－3' P2:5'－AGCTTTTCCAAAAATGTTCTGGGGTGTGGTGTCtctcttgaaGACACCACACCCCAGAAC AGGG－3'。

1. 4 構建針對人MMP－1 基因的shRNA 表達載體pWH1－MMP1

1.4.1 引物處理 將上述引物用TE(pH 8.0)稀釋成0.05 nmol/ml，－20 ℃保存。

1.4.2 酶切 用限制性內切酶BglⅡ和HindⅢ對質粒pWH1 做雙酶切。用膠回收試劑盒回收pWH1質粒片段。

1.4.3 連接 反應體系為pWH1 質粒片段4 μl，退火產物4 μl，T4 連接酶1 μl，T4 連接酶buffer 1 μl。16 ℃連接過夜。

1.4.4 轉化 將連接產物轉化大腸桿菌TOP10 感受態細胞，鋪于LB Kana ﹢平板上，37 ℃培養24 h。挑取單克隆并提取質粒。

1.4.5 酶切鑒定 用限制性內切酶EcoR Ⅰ和HindⅢ對候選陽性克隆質粒做雙酶切鑒定，陽性克隆質粒命名為pWH1－MMP1。

1.5 轉染 對數生長期ACC－M 細胞接種于6 孔培養板，待細胞長滿底面約80%時轉染細胞。分為3 組:(1)實驗組，轉染pWH1－MMP1 質粒;(2)空載體組，轉染pWH1 質粒;(3)對照組，未轉染。轉染步驟按LipofectamineTM2000 說明書進行。

1.6 RT－PCR 鑒定細胞MMP1 mRNA 的表達 按照TRIzol?試劑說明書步驟提取實驗組、空載體組和對照組細胞總RNA，溶于20 μl DEPC 水中。按照First Strand cDNA Synthesis kit 使用說明書反轉錄合成cDNA。以人β－actin 內對照進行PCR 反應，反應體系:cDNA 各1 μl，MMP1 和β－actin 的上游引物和下游引物各1 μl、MasterMix 12.5 μl、DEPC處理水補至反應體積25 μl。反應條件:95 ℃預變性1 min;94 ℃40 s、45 ℃40 s、72 ℃40 s，循環26次;7 ℃延伸10 min。取5 ml 反應液在12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳上進行擴增產物檢測分析。引物由上海Sangon 公司合成，序列如下:

人β－actin 引物長度680 bp，sense:5'－ATACGCTGGGATGAGCACTGG，antisense:5'－TCTTTGCGGATGTCCACGTC。人MMP－1 引物長度331 bp，sense:5'－CATGCTTTTCAACCAGGCCC;antisense:5'－ATTCTGTCCCTGAACAGCCC。

1.7 免疫組化方法 制備對數生長期Mc3 細胞爬片，95% 乙醇固定后，0.2% TritonX－100 處理10 min，按SP 免疫組化試劑盒步驟系列處理，DAB 顯色?？瞻讓φ找訮BS 代替一抗。

1.8 Western blot 方法 應用單去污裂解法提取三組細胞總蛋白，Bradford 比色法進行定量后，取等量樣本，收集蛋白。10% SDS－PAGE 蛋白電泳。轉移至NC 膜后用山羊抗人MMP－1 蛋白抗體進行Western 雜交檢測。

1.9 統計學處理 采用SPSS15.0 軟件，計量資料采用±s 表示，關于灰度值各組之間的比較采用方差分析，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pWH1－MMP1 的酶切鑒定結果 用EcoRⅠ和HindⅢ對pWH1－MMP1 進行雙酶切鑒定，陽性克隆切下約310 bp 片段，陰性克隆切下約250 bp 片段(圖1)。

圖1 pWH1－MMP1 質粒的酶切鑒定

2.2 RT－PCR 結果 三組細胞的內參對照物β－actin mRNA 的條帶無明顯差別，而實驗組MMP1 條帶的亮度明顯低于空載體組和對照組，這提示MMP1 mRNA 在實驗組細胞中的表達明顯降低(圖2)。

2.3 免疫組織化學法檢測MMP－1 蛋白結果 結果顯示，ACC－M 細胞和轉染pWH1 胞漿區顆粒狀棕黃色著色深而明顯，轉染pWH1－MMP1 的細胞胞漿區著色淡而淺。每組染色結果隨機抽取50 個細胞，采用病理圖像分析系統4.0 軟件進行灰度值檢測，ACC－M 細胞、轉染pWH1 的ACC－M 細胞和轉染pWH1－MMP1 的ACC－M 細胞胞漿灰度值分別為180.04±11.52、179.24 ±13.25 和120.85 ±12.16(P＜0.01)，可以看出，RNA 干涉后和親本細胞ACC－M相比MMP－1 基因的表達水平明顯下降(圖3)。

圖2 pWH1－MMP1 穩定轉染ACC－M 細胞后的RT－PCR 結果

圖3 pWH1－MMP1 穩定轉染ACC－M 細胞的免疫組化結果

2.4 Western blot 檢測MMP－1 蛋白結果 在預期大小位置(57ku)處實驗組MMP－1 蛋白表達水平明顯低于對照組(圖4)。

圖4 pWH1－MMP1 穩定轉染ACC－M細胞的western blot 結果

3 討論

在基質金屬蛋白酶家族中，MMP－1 是表達最高的降解纖維膠原的間質膠原酶，許多腫瘤組織中有MMP－1 的過表達，其表達與侵襲轉移和不良預后相關［1，2］。

Toruner 等［3］應用Affymetrix Hu133A 基因芯片檢測了口腔鱗狀細胞癌組織的基因表達，發現33 個上調基因，MMP－1 是其中之一，并經RT－PCR 得到驗證。Bendardaf 等［4］應用免疫組化法檢測了直腸癌中MMP－1 的表達，發現MMP－1 表達低的存活率高。Yamashita 等［5］研究了51 例食管癌，其中94.1%有MMP－1 mRNA 的表達，而在正常黏膜組織中卻未檢測到MMP－1 的表達，其研究結果提示MMP－1 參與腫瘤侵襲過程，與不良預后有關。Ito等［6］在研究MMP－1 與人胰腺導管腺癌的關系時發現，46 個胰腺癌病例中，72%MMP－1 蛋白染色陽性，原位雜交確認了MMP－1 mRNA 在胰腺癌中的表達，Ito 還檢測了2 個胰腺癌細胞系MMP－1 的mRNA 水平，發現MMP－1 陽性患者預后明顯不如MMP－1 陰性患者。Inoue 等［7］對103 例胃腸癌病例的研究發現，75.2%MMP－1 表達陽性，其表達與腹膜和淋巴轉移顯著相關，MMP－1 陽性患者預后不良。Boire 等［8］確定出一種能夠與特殊的蛋白酶活化受體(PAR1，與腫瘤侵襲轉移相關)反應的酶，即MMP－1，它能夠作為分子剪刀活化PAR1，從而刺激癌細胞的入侵和腫瘤的生長。

RNA 干涉(RNAi)技術能夠沉默靶基因，具有高度的特異性和高效性，用于多種基因功能的研究、腫瘤的試驗性治療等多項領域［9－12］。本課題組前期研究發現，在高轉移的人腺樣囊性癌ACC－M 細胞系中發現有高水平的MMP1 基因表達［13］，因此考慮MMP1 可能對人腺樣囊性癌生物學行為發揮重要的作用。在此基礎上，本研究根據siRNA 設計原則，設計合成了MMP－1 shRNA;利用RNAi 質粒pWH1 成功構建了真核表達載體pWH1－MMP1;確立了G418 篩選工作濃度為600 μg/ml;脂質體法轉染pWH1－MMP1 到ACC－M 細胞，經G418 篩選，獲得穩定轉染pWH1 和pWH1－MMP1 的ACC－M細胞。

RT－PCR 鑒定了穩定轉染后ACC－M 細胞MMP－1 的表達情況，發現穩定轉染的ACC－M 細胞MMP－1 mRNA 幾乎不表達。提示所設計的MMP－1 shRNA 符合設計要求，具有靶向特異性，達到了抑制靶基因的效果。

免疫組化法和Western blot 對穩定轉染細胞ACC－M 中MMP－1 蛋白表達水平的檢測進一步證實了MMP－1 shRNA 經pWH1 載體導入ACC－M細胞后能有效發揮RNAi 的靶基因沉默效應，即特異阻斷了MMP－1 在SACC 肺高轉移細胞株ACCM 中的表達。

RNAi 技術成功地沉默了MMP－1 基因在ACC－M 細胞中的表達，鑒于MMP－1 基因與腫瘤發生發展的相關性，這一結果為進行以MMP－1 基因為靶點的抗腫瘤研究建立了初步的實驗模型。這為進一步研究MMP1 對腺樣囊性癌以及其他腫瘤的生物學特性的影響，實驗性治療腺樣囊性癌以及其他腫瘤奠定了基礎。

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