玉米ZmAATP基因的克隆及遺傳轉化載體的構建

于林卉，劉保申，李文蘭，張憲省，趙翔宇

(山東農業大學，山東省作物生物學重點實驗室，作物生物學國家重點實驗室，山東 泰安 271018)

三磷酸腺苷(ATP)是生物體內主要的能源載體。ATP跨膜轉運是生物體能量運用的重要方式。ATP－ADP轉運蛋白(ATP－ADP translocator protein，AATP)是真核生物的一種腺苷酸轉運載體，是質體ATP濃度的主要調節者［1］。雖然葉綠體具有通過光合作用產生ATP的能力，但當夜間ATP不能直接產生時，則需要通過跨膜轉運的方式將ATP能量轉運到葉綠體內，維持其正常的生理代謝［2］。而在非光合質體中，一些依賴ATP的反應(如淀粉和脂肪酸合成)必須依靠從細胞質中轉運ATP來維持自身的生理代謝［3］。另有研究表明，增加細胞內ATP含量、降低細胞外ATP水平可抑制花藥開裂，由此發現ATP的外運是影響花粉成熟和授粉能力的一種新型的細胞外信號［4］。到目前為止，質體的ATP/ADP轉運被發現存在于所有高等和低等植物中［5］。AATP是一種普遍存在于質體膜上轉運載體，它能夠介導細胞質中高濃度的ATP轉運到質體腔內，同時專一地與質體腔內等量的ADP分子結合并轉移到膜外釋放［6］。由此可見，質體腔內一些依賴ATP提供能量的重要代謝途徑(如淀粉合成、脂肪酸合成等)均受到AATP活性的調控。

質體ATP－ADP轉運蛋白家族與腺苷酸轉運家族具有很高的同源性［7］。在擬南芥中，至少有兩組不同的轉運蛋白家族成員橫跨質體內膜介導ATP轉運。雙突變T－DNA插入敲除AtAATP1和AtAATP2導致一系列不同的表型，其中包括減少根系生長，延遲葉片葉綠素積累，種子中的脂肪含量減少等［8］。AtAATP1和AtAATP2為表達模式不同的異構體。AtAATPT1為糖誘導基因，主要在根和莖中表達，外源葡萄糖或蔗糖出現時其表達水平提高。AtAATP2則在幼根和子葉中表達量最高。在種子發育的脂類積累過程中AtAATP1和AtAATP2均有所表達。由此可見，質體中AATP蛋白的轉運活性對擬南芥種子中的脂質合成具有顯著的調節作用［8］。

在馬鈴薯塊莖中，質體ATP－ADP轉運蛋白(StAATP)調控塊莖內淀粉積累［9］，并且在此代謝途徑中具有較高的控制系數［10］。J.Tjaden等將AATP基因cDNA的正向和反向結構轉入馬鈴薯，結果表明，轉基因馬鈴薯塊莖中的AATP表達量受到相應影響，且正向表達結構轉基因馬鈴薯塊莖的淀粉含量從18.8%提高到22.7% ～27.0%，反向表達結構轉基因馬鈴薯塊莖的淀粉含量則下降到11.5% ～18.0%。事實上，ATP－ADP轉運蛋白在馬鈴薯淀粉合成途徑中的轉運活性控制系數達到0.78以上［10］。由于質體內部承載著廣泛的代謝途徑，推測ATP進入質體的過程受到損害將導致一系列不同表型。反義抑制StAATP1馬鈴薯已被證明不僅導致塊莖中淀粉含量下降，也導致塊莖出現不定芽等形態變化。同時，轉基因塊莖中對鏈格孢菌引起的馬鈴薯早疫病和歐文氏菌屬引起的馬鈴薯軟腐病的抗性增強，而且轉基因植株葉片對馬鈴薯晚疫病的抗性也有所增加［11，12］。這種增強抗病性的機理仍不清楚，但可能與觸發已知的植物防御基因、增加H2O2的釋放能力有關［12，13］。Tremblay等利用RNA干擾的方式敲除ATP－ADP轉運蛋白，轉基因馬鈴薯塊莖中合成物質積累增加了30%，塊莖中可溶性蛋白含量比野生型增加近50%［14］。由此可見，ATP－ADP轉運蛋白是植物質體能量代謝中必不可少的能量轉運載體，同時在植物一系列ATP依賴的生理代謝途徑中發揮著重要的作用。

淀粉是谷類作物胚乳中貯存光合能量的主要方式。玉米作為重要的糧食作物，其籽粒中淀粉含量占總粒重的70～80%。在玉米籽粒淀粉合成途徑中，ADP－葡萄糖(ADP－Glc)是淀粉合成的直接前體，它是由ATP供能在ADP－葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的催化作用下在細胞質中生成［15］。在淀粉質體內多種淀粉酶均需要在ATP供能的條件下來完成相應的催化反應從而合成淀粉。研究表明，水稻AATP在花后6～7d的幼穗中具有較強的表達，尤其在淀粉合成旺盛進行的灌漿中期，穗內OsAATP基因的合成代謝增強［16］。另外，植物細胞的胞質和淀粉體中有很高的ATP/ADP比率，提高細胞質內ATP的濃度，可以影響AGPase和淀粉酶的催化活性，促進淀粉合成。因此，具有調動ATP進入淀粉體的能力是維持質體內淀粉合成的基本需求。提高植物細胞內可利用的ATP含量，增加限速步驟中的能量來源，則可能促進淀粉合成速率和改變淀粉結構。由此可見，ATP－ADP轉運蛋白在淀粉合成中起到的重要的作用［9］。

所有的質體ATP－ADP轉運蛋白，如擬南芥AtNTT轉運蛋白，馬鈴薯StAATP轉運蛋白，均在特異性底物和底物親和力方面表現出類似的輸運性質［5，9，17］。由此可見，在玉米中ATP－ADP轉運蛋白必然在植株能量供應和非光合質體內代謝合成等生理活動中發揮重要作用。因此，尋找玉米中存在的ATPADP轉運蛋白同源基因，確定ZmAATP蛋白在玉米生長發育過程中細胞內能量代謝和質體物質交換等方面的生理作用，以期待其在提高玉米籽粒的淀粉合成能力上發揮重要作用。

本研究克隆了玉米ZmAATP基因并構建其玉米遺傳轉化載體，為進一步研究該基因在玉米籽粒發育和物質積累中的生物學功能奠定了基礎。

2 材料與方法

2.1 植物材料

所取植物材料為玉米Q319自交系的根、莖、葉片、成熟子房、授粉后3 d種子(Days After Pollination，DAP)、8DAP種子、15DAP胚、15DAP胚乳、20DAP胚、20DAP胚乳、25DAP胚、25DAP胚乳，材料種植在山東省泰安市農科院實驗田。

2.2 實驗方法

2.2.1 植物組織總RNA的提取 利用Trizol試劑盒(上海生物工程公司)提取不同材料的總RNA，MMLV逆轉錄酶生成cDNA模板，－20℃保存。

2.2.2 玉米ZmAATP基因的克隆 基因克隆利用的是BioLabs公司的Phusion超保真DNA聚合酶試劑盒。以玉米胚乳的cDNA為模板，PCR擴增獲得目的基因片段。基因克隆引物(上海生物工程公司合成)為:AATP－5:5＇－GCAGATCTGCCACTGTCATTATTTATAGCCA－3＇，AATP－3:5＇－TAAGATCTGTAGCAAGCACGAAGCAGCAAAG－3＇。

PCR 反應總體積為 25.00 μL:5 × Phusion GC buffer 5.00 μL，dNTP(10 mM each)2.00 μL，cDNA template 2.00 μL，Forward Primer(5mM)2.50(L，Reverse Primer(5mM)2.50 μL，ddH2O 10.75(L，Phusion DNA polymerase 0.25 μL。AATP 基因擴增條件為:98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，56 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s，34個循環，72℃10 min，4℃結束反應。瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，－20℃保存。將目的片段連接到平末端克隆載體PJet 1.2/blunt Vector上(Fermenta公司)，22℃連接30 min。鑒定陽性質粒測序，利用分子生物學軟件DNAMAN對測序結果與目的序列進行比對確認。

2.2.3 系統進化分析 通過檢索GenBank數據庫和利用DNAMAN軟件進行多重序列比較和同源性分析。用 NCBI的 blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.)對 ZmAATP 基因的氨基酸序列進行比對，在 NCBI上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析基因的功能區。采用分子生物學軟件DNAMAN分析ZmAATP氨基酸序列的系統進化關系。

2.2.4 熒光定量PCR分析 將反轉錄所得cDNA樣品稀釋至0.5～2 ng/μL。RT－PCR按SYBR Green PCR Master Mix說明書進行操作。使用18 sRNA作為內參基因，相同反應條件進行PCR擴增。擴增引物為:18s－S:5＇－GATACCGTCCTAGTCTCAACC－3＇;18s－A:5＇－GCCTTGCGACCATACTCC－3＇;AATP－DS:5＇－CTGCTGCTGCTGCTAAGG－3＇;AATP－D:5＇－TTGCTCATCTTAGTGTCCTTCC－3＇。PCR 反應條件如下:95.0 ℃ 3 min;95.0 ℃ 10 s;63.0 ℃ 20 s;72.0 ℃ 15 s;Plate Read;Goto line 2 for 45 more times;Incubate at 65℃ for 20 s;Melting curve from 65 ℃ to 95 ℃，read every 0.5 ℃，hold 20 s;End。

2.2.5 基因表達載體的構建 用限制性內切酶BglⅡ單酶切攜帶ZmAATP基因的克隆載體，同時用限制性內切酶BamHⅠ單酶切pZP211::Ubi和pZP211::GluAⅠ空載體，回收目的片段和載體線性片段，T4連接酶連接。PCR篩選正向連接菌落，提取質粒－20℃保存。

3 實驗結果

3.1 ZmAATP基因的克隆

在NCBI數據庫中，檢索擬南芥AtAATP基因在玉米基因組中的同源序列，根據目的序列設計引物，利用高保真酶從玉米自交系齊319的胚乳cDNA中特異性擴增并獲得約1.7 Kb目的條帶。經測序，該基因片段全長為1704 bp，其中開放式閱讀框部分為1590 bp，由此推得，該基因編碼530個氨基酸，并將其命名為ZmAATP(Zea mays.AATP)。通過在玉米MaizeGDB數據庫中分析發現，ZmAATP基因定位在玉米基因組第1條染色體上，預測編碼玉米ATP－ADP轉運蛋白。生物信息學軟件DNAMAN分析預測，ZmAATP蛋白質分子量為59.7KD，蛋白的等電點(PI)約為6.12。將其氨基酸序列在GenBank中檢索，發現與已發現的 ZmATPase3(玉米，NP_001148126.1)、TaAATP(小麥，ACJ22514.1)、OsAATP(水稻，ABA97668.2)、AsAATP1(擬南芥，NP_198817.1)相比，氨基酸同源性分別為80%、79%、71%、55%，相似性比較如圖1所示。

3.2 玉米ZmAATP基因的進化樹分析

利用NCBI Blast程序和DNAMAN生物軟件對ZmAATP基因的氨基酸序列與其它相近氨基酸進行比對分析(圖2)。由ATP－ADP轉運蛋白的同源關系可知，與ZmAATP親緣關系最近的是玉米的ZmATPase3，同源性達到80%，以及高粱屬中的一種未知蛋白，同源性為78%。由ZmAATP的系統發育關系可知，ZmAATP與兩種蛋白的親緣關系最近，分別是ATPase和與細胞分裂有關的ATPase蛋白家族。ZmAATP與大麥HvATPase和擬南芥AtAATP1同源關系分別為69%和55%。ZmAATP與小麥TaCDAP、水稻OsCDAP細胞分裂有關ATPase蛋白的同源關系分別為78%和71%。ZmAATP的氨基酸序列與ATPase酶的親緣關系最近，并且部分ATPase的基因表達與細胞分裂相關，因此，ZmAATP蛋白的功能可能與ATPase相近，表現出具有與ATP代謝能力相關的性質，并且可以預見在細胞分裂旺盛的部位AATP蛋白具有一定的表達，這也與已知的AATP同源基因的生理功能相吻合。

圖1 ZmAATP蛋白與玉米(Zea mays)的ZmATGase3、小麥(Triticum aestivum)的TaAATP蛋白、水稻(Oryza sativa)的OsAATP蛋白、擬南芥(Arabidopsis thaliana)的AtAATP1蛋白的氨基酸序列比對。黑色部分表示相同的氨基酸殘基。Fig.1 Alignment of amino acid sequences of ZmAATP(Zea mays)，ZmATPase3(Zea mays)，TaAATP(Triticum aestivum)，OsAATP(Oryza sativa)and AtAATP1(Arabidopsis thaliana). Identical amino acid residues are shaded inblack.

我們利用NCBI Blast分析程序對ZmAATP蛋白序列結果進行保守區分析。結果如圖3所示，ZmAATP含有一個AAA P－loop NTPase superfamily結構域，在序列第255個氨基酸附近具有一個ATP結合位點，其后連接一個線粒體跨膜轉運的結構域，由此可見，玉米ATP－ADP轉運蛋白與ATP具有一定的親和力，并且具有可以通過質體內膜進行跨膜轉運的能力。ZmAATP蛋白這一結構域說明其在玉米植株內具有與ATP能量代謝相關的生理功能，并且能夠為玉米植株正常的生理活動提供能量。

3.3 玉米ZmAATP基因的表達模式分析

為了進一步研究ZmAATP基因在玉米植株中表達模式，我們利用實時熒光定量PCR技術對ZmAATP基因在不同發育時期的不同玉米組織中的表達模式進行分析。分別以玉米根(R)、莖(S)、葉(L)、成熟子房(Ov)、授粉后3 d種子(Days After Pollination，DAP)、8DAP種子、15DAP胚、15DAP胚乳、20DAP胚、20DAP胚乳、25DAP胚、25DAP胚乳的cDNA為模板，設計引物進行熒光定量PCR擴增。從結果中可以看出(圖4)，ZmAATP基因在玉米植株中呈現組織特異性表達。在玉米根、莖、葉中表達量較低，成熟子房中有一定的表達量，而授粉后其基因的表達量降低，但隨著玉米籽粒的發育，ZmAATP基因的表達量逐漸提高，并在授粉后25 d的種子內表達量達到最大值。

3.4 玉米ZmAATP基因表達載體的構建

為了進一步利用轉基因技術研究該基因的生物學作用，我們構建了不同啟動子驅動該基因的表達載體。本實驗所用表達載體骨架是pZP211，啟動子為組成型表達的Ubi(ubiquitin)啟動子和胚乳特異型啟動子GluAⅠ。在基因擴增時在ZmAATP引物兩端添加BglⅡ酶切位點，其中，BamHⅠ和BglⅡ為具有相同黏性末端的同尾酶。將已經獲得的、測序無誤的ZmAATP基因片段經限制性內切酶BglⅡ單酶切后，連接到pZP211載體的Ubi啟動子和GluAⅠ啟動子下游的BamHⅠ酶切位點，構建組成型表達載體pZP211Ubi::AATP以及胚乳特異性表達載體pZP211GluA1::AATP。載體圖與酶切檢測結果如圖5所示。

圖5 玉米ZmAATP基因的載體圖與酶切檢測結果Fig.5 The expression vector map of ZmAATP gene and the result of cutting the vector of ZmAATP gene using restriction enzymes.

4 討論

玉米籽粒是玉米最重要的營養器官，籽粒中貯藏淀粉的含量占總粒重的70% ～80%。因此，提高籽粒中淀粉含量，對玉米提高產量具有重要作用。淀粉質體是玉米胚乳細胞內淀粉合成的主要場所，質體內含有淀粉合成一系列關鍵酶及同工酶。淀粉合成底物ADP－葡萄糖是在ATP供能的條件下由ADP－葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化在細胞質中生成［18］。胚乳細胞的淀粉合成前體ADP－Glc必須經過質體內膜上的轉運蛋白跨膜轉運才能參與淀粉合成，而ADP－Glc的轉運則需要質體內等量ADP交換才能完成［15］。在這過程中，細胞質中AGPase和質體內一系列淀粉酶的催化反應均需要ATP供能，酶的活性受到ATP的調控，因此，具有調動ATP進入淀粉體的能力是維持質體內淀粉合成的基本需求［19］。由此可見，ATP－ADP轉運蛋白在維持玉米胚乳細胞的正常淀粉合成途徑中發揮重要的作用。

克隆得到的ZmAATP(NM_001176243)的基因，編碼玉米胚乳細胞ATP－ADP腺苷酸轉運蛋白。該基因在玉米植株中特異性表達，其表達蛋白與玉米ZmATPase3同源性為80%，擬南芥AtAATP1同源性為55%，含有ATP結合域和線粒體跨膜轉運結構域。可以預測ZmAATP蛋白的功能與ATPase功能相近，可能具有ATP酶的活性，該基因也必然會在ATP能量代謝和ATP跨膜轉運中發揮作用。ZmAATP基因主要在種子中表達，并且隨著授粉后玉米籽粒的發育其表達量逐漸提高。授粉后，籽粒中ZmAATP基因的表達量有所下降，這種變化可能是由于受精作用導致籽粒中基因表達模式發生劇烈變化所致。然而隨著授粉后種子的發育和物質代謝的進行，無論是胚中還是胚乳中ZmAATP基因的表達量均隨授粉后時間的增加而逐漸增大，并且在授粉后13 d左右其表達量急劇增強，最終在籽粒發育成熟時達到最高峰。前人研究表明，在水稻籽粒灌漿期間OsAATP的表達量有所提高［16］，此時ZmAATP的高水平表達同水稻中的表達相一致。由此推測授粉后13 d左右也玉米籽粒的灌漿期，此時籽粒內淀粉合成和新陳代謝旺盛進行，細胞分裂能力增強，物質積累對能量需求增加，需要AATP轉運大量的ATP能量為籽粒內的生理活動供能。由此可見，ZmAATP基因在玉米籽粒灌漿中期胚和胚乳中的表達量急劇升高，反映了AATP轉運蛋白在非光合質體能量供應和物質代謝中的重要作用。

另外，在玉米籽粒的胚和胚乳中均有ZmAATP基因的表達，而在玉米胚乳中的表達量明顯高于其在胚中的表達量。由于淀粉是玉米籽粒主要的貯藏物質，ZmAATP基因的表達與淀粉合成直接相關，因此，在胚乳細胞中該基因的表達較高。因此，可以期待同源的玉米ZmAATP基因，在促進玉米胚乳內的淀粉合成，提高籽粒中的淀粉含量等方面做出一定的貢獻。而在玉米胚中含有大量脂類代謝物，胚中具有獨立的脂肪代謝途徑。有研究表明，在擬南芥種子的脂類積累過程中AtAATP1和AtAATP2均有一定的表達量［8］。另外，ATP也是脂肪酸合成途徑的能量供體，由此可以預見AATP基因在胚內脂類合成的過程中也將發揮一定作用。據此推測，ZmAATP轉運蛋白參與到玉米胚內脂肪酸合成的過程中，為玉米胚的發育提供能量。這也說明AATP基因在種子的胚和胚乳的發育中均發揮作用，在提供淀粉合成和脂肪酸合成所需能量，促進玉米籽粒物質積累、籽粒成熟等生理活動中扮演著重要的角色。

綜上所述，ZmAATP基因在玉米種子內貯藏物質合成和質體內能量代謝等方面發揮重要作用，在促進玉米籽粒發育和物質積累等生理活動中扮演著重要的角色。依據ATP－ADP轉運蛋白的性質，我們構建了玉米組成型啟動子(Ubi)和胚乳特異性啟動子(GluAⅠ)啟動的ZmAATP基因的過量表達載體。利用轉基因技術提高ZmAATP在玉米植株和胚乳中的表達量，進一步驗證ZmAATP的基因功能及在玉米淀粉合成和種子發育中的重要作用，并且對于促進玉米籽粒中淀粉和脂類合成，提高籽粒粒重，增加玉米產量等方面具有重要意義。

5 結論

本研究克隆得到一個玉米ZmAATP基因，預測其表達蛋白具有ATPase活性，證明其在授粉后玉米籽粒的發育和物質積累過程中具有較高表達，構建了分別由組成型啟動子(Ubi)和胚乳特異型啟動子(GluAⅠ)驅動的ZmAATP基因的過表達載體，為進一步研究該基因在玉米中的生物學功能奠定了基礎。

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