以銪離子為熒光探針測定痕量環丙沙星

苗延虹

(山東農業大學化學院，山東泰安 271000)

1 前言

環丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)是喹諾酮類藥物中的第三代產品——氟喹諾酮類藥物。別名丙氟哌酸，悉復欣、環丙氟哌酸，結構見下圖:

環丙沙星具備廣譜抗菌活性，殺菌效果好，具有高效、低毒以及口服吸收完全、體內分布廣、不易產生抗藥性等特點，是目前最佳的抗感染藥物之一。除用于人醫臨床外，已進入獸用領域。主要用來預防和治療動物疾?。?，2］，廣泛應用于畜禽、水產養殖中。因此建立可靠、靈敏、簡便、快速的測定方法對于研究環丙沙星的藥理，臨床醫學和生物殘留具有重要的實際意義。

有關環丙沙星的分析方法，文獻報道的有高效液相色譜法［3，4］、分光光度法［5］、原子吸收光譜法［6］和電分析方法［7，8］、液相色譜－串聯質譜法［9，10］、熒光光譜分析法［11－14］等。其中熒光分析法是一種靈敏度高、選擇性好、簡便快速的分子發射光譜分析法。

圖1 環丙沙星結構圖Fig.1 Structure of Ciprofloxacin

本文利用熒光光譜和吸收光譜研究了Eu3+、CIP與SDS的相互作用。環丙沙星是Eu3+的理想配體，所生成的二元配合物通過分子內能量轉移，使Eu3+激發，并發射其位于615 nm的特征熒光，具有熒光量子產率高、Stokes位移大、發射峰窄以及熒光壽命長的優點。加入陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)后，銪離子位于615 nm處的特征熒光能夠被顯著增強。據此，本文以Eu3+作為熒光探針，建立了一種測量環丙沙星的新方法。該方法靈敏度高、選擇性好、干擾少、操作簡單，用于實際樣品的測定，結果令人滿意。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

2.1.1 儀器 UV－240型紫外可見分光光度計(日本島津公司)，Cary Eclipse熒光分光光度計(美國VARIAN公司)，pHS－3精密酸度計(上海自動化儀表有限公司)。

2.1.2 試劑 針劑乳酸環丙沙星氯化鈉注射液(山東魯抗辰欣藥業有限公司，國藥準字H2004598，0.2 g*100 mL/瓶，樣品1);鹽酸環丙沙星片劑(萊陽市江波制藥有限責任公司250 mg∕片，按環丙沙星計，樣品2);

氧化銪Eu2O3(99.99%，上海晶純試劑有限公司);β－環糊精(上海晶純試劑有限公司，99%);分析純;十六烷基三甲基溴化銨CATB(天津市巴斯夫化工有限公司，分析純);曲拉通X－114;十二烷基硫酸鈉(SDS，天津市巴斯夫化工有限公司):準確稱取一定量SDS，溶于水得濃度為7.299×10－2mol·dm－3的儲備液。使用前以石英亞沸蒸餾水稀釋即得7.299×10－4mol·dm－3的工作液;環丙沙星儲備液(中國藥品生物制品檢定所):準確稱取一定量環丙沙星，以石英亞沸蒸餾水溶解定容得2.460×10－2mol·dm－3的儲備液。使用時以石英亞沸蒸餾水逐級稀釋即得工作液(2.460×10－4mol·dm－3);Eu3+儲備液:準確稱取2.3280 g Eu2O3(99.99%)，加入少量濃鹽酸，再加入少量過氧化氫，緩慢加熱使其溶解，并揮發近至干，然后用0.1 mol·dm－3的稀鹽酸稀釋至100 mL，作為儲備液，使用時以石英亞沸蒸餾水稀釋即得工作液(6.615 ×10－3mol·dm－3);0.01 mol·dm－3Tris－HCl緩沖溶液，pH=8.02。

以上儲備液與工作液均需置于0～4℃的生化培養箱內保存。所有試劑均為分析純，實驗用水均為石英亞沸二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

于 10 mL比色管中依次加入1 mL pH=8.02 的 Tris– HCl(0.01 mol·dm－3)緩沖溶液、1.0 mL 2.460 ×10－4mol·dm－3環丙沙星、1.0 mL 7.299 ×10－4mol·dm－3SDS 和 1.0 mL 6.615 ×10－3mol·dm－3Eu3+，再用石英亞沸蒸餾水定容至刻度10.0 mL，振蕩搖勻，放置40 min，記錄其熒光光譜。在λex/λem=265 nm/615 nm，(激發和發射通帶均為5 nm)處，用1 cm石英熒光液池，測定溶液的相對熒光強度F，同時測定試劑空白F0。

3 結果與討論

3.1 熒光光譜與吸收光譜

按照實驗方法，繪制Eu3+、CIP、CIP－Eu3+和CIP－Eu3+－SDS的發射光譜(見圖2)。

由曲線1可以看出，單獨的Eu3+水溶液不能檢測到Eu3+的特征光譜。比較曲線3和曲線4可看出，當在Eu3+溶液中加入CIP后，CIP在429 nm處的發射強度明顯降低，并出現595 nm和615 nm較強的Eu3+的特征熒光峰，分別對應于Eu3+的5D0→7F1，5D0→7F2的躍遷。說明CIP和Eu3+生成二元配合物，通過分子內能量轉移過程，使Eu3+激發，并發射銪離子強的特征熒光，曲線2由于表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的加入，改善了Eu3+與CIP的配位微環境，減少了水分子與絡合物的結合，使體系的熒光強度大約增強3倍。

CIP、CIP－Eu3+、CIP－Eu3+－SDS的吸收光譜見圖3，比較曲線1和曲線2，發現在CIP中加入Eu3+后，吸光度降低，發生紅移，說明生成二元配合物。比較曲線2和曲線3，發現在CIP－Eu3+體系中加入SDS后，峰位未變，吸光度增強，這是由于膠束的保護作用，減少了發光離子激發態無輻射去活造成的能量損失，使體系的熒光量子產率提高，熒光強度進一步增強。

3.2 影響體系熒光強度的因素

3.2.1 體系酸度對熒光強度的影響 CIP分子中含有3－羧基－4－氧喹諾酮環系，7位有一個哌嗪取代基(圖1)，分子中的N原子與O原子在不同酸堿度溶液中的質子化程度將直接影響發光體系電子的性質以及電子云分布［15］。因此溶液的pH值會對體系的熒光強度產生較大的影響。

在 pH值7.26～8.42的范圍內測定了CIP－Eu3+－SDS體系的熒光強度，結果見圖4。如圖所示，pH=8.02時，體系的熒光強度最強，說明在此酸度下有利于形成穩定的發光配合物。固定pH值為8.02，實驗了(CH2)6N4－HCl、NH4Cl－NH3、Tris－HCl、NH4A c－HAc四種不同的緩沖溶液對體系熒光強度產生的影響，結果表明，在Tris－HCl體系中Eu3+敏化熒光強度最大且穩定，因此選擇濃度為0.01 mol·dm－3pH=8.02的Tris–HCl緩沖溶液做進一步的研究。

圖4 緩沖溶液酸度對熒光強度的影響Fig.4 The influence of pH on F

3.2.2 緩沖溶液用量對 CIP－Eu3+－SDS體系熒光強度的影響 在pH=8.02條件下，探討了緩沖溶液的用量對體系熒光強度的影響，如下圖所示:

由圖5可知，Tris－HCl緩沖溶液的加入量為0.5～2.0 mL時，熒光強度最大且基本穩定，故本文選擇加入1.0 mLTris–HCl緩沖溶液(0.01 mol·dm－3)做進一步的研究。

3.2.3 加入順序對體系熒光強度的影響 在同樣的濃度條件下 ，按緩沖溶液、環丙沙星、Eu3+、SDS的順序加入時，體系的熒光強度F最大，加入穩定性也更好 ，穩定時間更長。說明這個加入順序最有利于配合物的生成，故本文選擇上述加入順序。

3.2.4 表面活性劑的種類及用量的影響 實驗了不同的表面活性劑Triton X－114、β－環糊精、SDS、CATB對體系的增敏作用。其中，Triton X－114、β－環糊精、CATB對體系無增敏作用，只有SDS的增敏效果最好。分析原因主要是稀土離子絡合物帶正電荷，而SDS是陰離子表面活性劑，帶有負電荷，兩者更容易結合。SDS的濃度為7.299×10－5mo l·dm－3時，其用量為1.0 mL最佳。如圖所示:

3.2.5 環丙沙星和Eu3+濃度的影響 環丙沙星和Eu3+的濃度對CIP－Eu3+－SDS體系熒光強度(F)的影響見圖7。由圖7可知，CEu3+:CCIP在10～40的范圍內時，體系的熒光強度穩定且熒光強度F最大。故本文選擇 CEu3+:CCIP=27:1(即濃度為 2.460 ×10－4mol·dm－3的環丙沙星 1.0 mL，濃度為 6.615 ×10－3mol·dm－3的 Eu3+1.0 mL)進行下一步研究。

圖7 環丙沙星和Eu3+的濃度對體系F的影響Fig.7 Effect of CIP concentration and Eu3+concentration on F

3.2.6 反應時間對體系熒光強度的影響 反應時間對體系的熒光值有較大的影響，由圖8可知體系在40 min后熒光值基本達到穩定，故本文選擇40 min后開始測定。

圖8 反應時間對體系的熒光強度的影響Fig.8 Effect of reaction time on the fluorescence intensity of system

3.2.7 測定CIP的線性范圍與檢出限 在最佳實驗條件下，繪制了CIP校準曲線，在CIP－Eu3+－SDS體系中，CIP的濃度變化與體系在λex/λem=265 nm/615 nm處的F，呈現良好的線性關系，線性方程 Y=－59.32+9.710X，相關系數 r=0.9965，方法的線性范圍 2.46 ×10－7mo l·dm－3～ 9.84 ×10－5mo l·dm－3，檢出限為1.92 ×10－7mol·dm－3。

3.3 樣品中 CIP的測定

取1支針劑用石英亞沸二次蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，另取2片藥片，加入20% 的三氯乙酸，溶解，抽濾，濾液用石英亞沸二次蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，再分別逐級稀釋至測定CIP的線性范圍之內。測定結果見下表。

樣品中CIP的測定Table Determination of CIP in injection and tablet samples(n=3)

由上表可以看出本方法對測定CIP含量有較好的準確性和重現性。

4 體系CIP－Eu3+－SDS熒光增強機理的探討

環丙沙星含有A－酮酸結構，是銪離子的理想配體，而且可以通過分子內能量轉移敏化銪的特征熒光。加入陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)后，進一步增強了體系的熒光強度。

從圖2可以看出，在CIP體系中加入Eu3+后，CIP在429 nm處的發射強度明顯降低，并出現595 nm和615 nm較強的Eu3+的特征熒光峰，說明發生了分子內能量轉移，生成了CIP－Eu3+二元配合物。加入SDS后，生成三元配合物，更有利于能量轉移。從圖3也可以看出，CIP－Eu3+－SDS體系的吸收光譜與CIP－Eu3+體系的非常相似，但強度增大了。也說明生成了CIP－Eu3+－SDS三元絡合物。

Eu3+是6～8個配位數的稀土離子，實驗中Eu3+與CIP濃度比為27∶1，是不飽和配位，在水溶液中，CIP－Eu3+易與水分子配位形成CIP－Eu3+－(OH2)n配位結構。

CIP－Eu3+－(OH2)n配合物中的Eu3+有多余的正電荷，很容易與SDS上的十二烷基磺酸根負離子通過靜電作用相互結合，另外，SDS上的十二烷基磺酸根負離子中的 O還可取代 (OH2)n與Eu3+配位生成具有緊密結構的三元配合物，伴隨著放出CIP－Eu3+－(OH2)n配合物中的H2O，從而降低了水分子中O—H鍵振動引起的非輻射能量損失。因此，SDS的加入，減少分子內活化過程及熒光猝滅效應，使得熒光增強。

［1］Küng K，Riond JL，Wanner M.Pharmacokinetics of enrofloxacin and its metabolite ciprofloxacin after intravenous and oral administration of enrofloxacin in dogs［J］.J Vet Pharmacol Ther，1993，16(4):462－8

［2］Mack G.Improved high－performance liquid chromatographic determination of ciprofloxacin and its metabolites in human specimens［J］.J Chromatogr，1992，6，582(1－2):263－7

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:二部［M］.北京:化學工業出版社，2005.525－27

［4］Olutosin R I，James O P.Simple，rapid determination oenrofloxacin and ciprofloxacin in bovine milk and plasma by high－performance liquid chromatography with fluorescence detection［J］.J.P harm Biomed Anal，2004，35(1):143－153

［5］劉 健，王建華.雙波長紫外分光光度法測定鹽酸環丙沙星膜劑含量［J］.齊魯藥事，2004，23(2):18－18

［6］宋雅茹，王尚芝.火焰原子吸收光譜法測定鹽酸環丙沙星［J］.北京師范大學學報(自然科學版)，2002，38(1):80－83.

［7］周谷珍，陳望愛，孫元喜.聚中性紅薄膜修飾電極測定鹽酸環丙沙星含量［J］.中國抗生素雜志，2007，32(5):305－307

［8］易蘭花，王俊芬，黎拒難，等.碳糊電極陽極吸附伏安法測定環丙沙星［J］.化學研究，2005，16(1):59－61

［9］陳笑梅，池浩超，劉海山，等.液相色譜串聯質譜檢測鰻魚中四種氟喹諾酮殘留［J］.生命科學儀器，2005，3(5):20－23

［10］B Toussaint，M Chedin.Determination of(fluoric)quinolone antibiotic residues in pig kidney using liquid chromatography－tandem mass spectrometry I.Laboratory－validated method［J］.J Chromatogram，2005，1088(1):32－39

［11］王靜萍，杜黎明，許慶勤.同步一導數熒光光譜法直接測定人體尿液中的鹽酸環丙沙星的方法研究［J］.分析科學學報，2001，17(2):135一137

［12］R C Rodriacuteguez－Diacuteaza，M PAguilar－Caballosa，A Goacutemez－Hensa .Sensitive Determination of Fluoroquinolone Antibiotics in Milk Samples Using Time一 Resolved Methodology［J］.Taylor＆Francis，2004，37(6):1163 一1175

［13］Chateau MT，Caravano R.Rapid fluorometric measurement of the intra－cellular concentration of ciprofloxacin in mouse peritoneal macrophages［J］.J Antimicrob Chemother，1993，31(2):281－287

［14］連 寧，孫春燕，趙慧春.加替沙星的熒光光度測定［J］.分析測試學報，2002，21(1):79－80

［15］孟慶裕，陳寶玖，趙曉霞，等.Eu3+或Tb3+摻雜Y2O3納米材料紫外激發光譜［J］.發光學報，2008，2(1):107－113