超表達OsSsr1基因增強煙草耐鹽性

封 偉，肖姍姍，常閃閃，劉鳳權，邵 敏

(南京農業大學植物保護學院/農作物生物災害綜合治理教育部重點實驗室，江蘇南京210095)

土壤鹽漬化是影響農業生產的一個全球性問題。在世界范圍內，灌溉土地的1/3受到鹽分脅迫，并且過量的灌溉及降雨的缺乏等一系列因素加劇了鹽漬化程度，使土地鹽漬化面積逐年增加，已經成為農業可持續發展的制約因素［1］。當前，研究植物鹽脅迫分子機制，尋找提高植物耐鹽脅迫方法、培育耐鹽植株，成為科學研究的一個熱點［2］。

OsSsr1基因是一個未知功能基因。本實驗室將Harpin蛋白編碼基因hrf1基因轉入水稻獲得的轉基因系NJH12具有對干旱等非生物脅迫和生物脅迫的耐性［3］。在NJH12的表達譜中，發現OsSsr1基因表達上調2.8倍，可能與植物的逆境脅迫反應有關(未發表數據)。本研究利用農桿菌介導法將來自水稻Os-Ssr1基因轉入煙草，發現OsSsr1的超表達促進了脯氨酸的積累和活性氧清除能力的提高，從而增強了轉基因煙草對NaCl的耐受能力。

1 材料與方法

1.1 材料

轉基因受體煙草:本氏煙(Nicotiana benthamiana)。

植物雙元表達載體pVec8由江蘇省農科院楊杰副研究員提供。在pVec8的BamHI和KpnI兩個酶切位點間加入水稻OsSsr1基因，構建載體pVOsSsr1(圖1)，并將其導入土壤根癌桿菌LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)，用于轉化煙草。

圖1 煙草轉基因載體pVOsSsr1示意圖Fig.1 Schematic diagram of plant expression plasmid pVOsSsr1

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR和 PCR－ Southern分析 用Trizol Reagent(Invitrogen)提取煙草總RNA［4］。根據OsSsr1的cDNA 序列設計引物OsSsr1－F2:5＇－ TGTTCATTGCCGGAGTTACCAAGTA －3＇;OsSsr1 －R2:5＇－ TTCAACCACGC CCAAGTCCAT－3＇，用于 RT－ PCR 反應用One Step RNA PCR Kit(Takara，大連)進行RT－ PCR 擴增，反應體積為50 μL，RNA 量1 μg，10 μM 的上下游引物各 2 μL，RNA 酶抑制劑 40 U，10 × Buffer 5 μL，25 mM的MgCl210 μL，10 mM 的 dNTP Mixture 5 μL，MAV 反轉錄酶5 U。反應條件:50℃，30 min;94℃，2 min;94℃，30 s;48℃，30 s;72℃，1 min;30個循環;延伸72℃，7 min。RT－PCR產物經1%瓊脂糖電泳分離后轉至尼龍膜上，用上述進行RT－PCR的引物及PCR DIG探針合成試劑盒(Roche公司)標記相應的cDNA為探針，按照Engler－Blum［5］描述的方法進行Southern雜交，檢測尼龍膜上的PCR產物。

1.2.2 轉基因煙草的獲得 通過土壤根癌桿菌介導的方法，由潮霉素篩選，分化后獲得T0代轉基因植株，并進行分子驗證留取陽性植株。通過RT－PCR和PCR－Southern對T1代轉基因植株的目的基因進行驗證，剔除假陽性植株。

無菌條件下將兩個T1代轉基因株系T1－3，T1－4的種子裝入滅菌1.5 mL EP管中。加入1 mL 30%的雙氧水，放入搖床中180 rpm，28℃消毒10 min。用滅菌水沖洗5次以上，并將轉基因種子轉入含有40 mg/L潮霉素的1/2 MS培養基上，26℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養。本氏煙野生型(WT)種子經消毒后，放入不含潮霉素的1/2 MS培養皿中，相同條件下培養。將生長兩周的幼苗移栽到由蛭石固定的花盆中，澆Hoagland營養液。在溫室培養3周，在此期間提取轉基因煙草的基因組進行PCR篩選。

1.2.3 鹽脅迫處理 兩周齡幼苗鹽脅迫處理:將幼苗轉入加有0.2 M NaCl的1/2 MS培養基上，28℃培養3天。再將幼苗轉入不含NaCl的1/2 MS培養基上培養10 d觀察拍照。

五周齡植株脅迫處理:把 Hoagland營養液培養的T1－3，T1－4和 WT煙草用0.15 M NaCl處理12 d，分別在處理過程的第3、6、9、12 d取樣，采用李合生等［6］的方法，測定煙草葉片中丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量及超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性的測定。

2 結果與分析

2.1 轉基因煙草的檢測

對2個具有潮霉素抗性株系的T1代植株(T1－3，T1－4)及野生型植株(WT)進行RT－PCR檢測結果表明(圖2)，潮霉素抗性植株得到與目的片段(547 bp)大小一致的產物，而野生型植株則無條帶。

圖2 轉基因煙草的RT－PCR(A)和PCR－Southern(B)雜交檢測Fig.2 RT －PCR(A)and Southern blot analysis(B)of transgenic tobacco plants WT，wild－type;T1－3、T1－4，transgenic tobacco lines

為進一步明確擴增產物是否為目的基因片段，將電泳分離的PCR產物進行PCR－Southern雜交，結果表明PCR擴增得到的特異片段是目的基因的擴增產物，進而說明外源基因已整合到煙草基因組中，并遺傳到T1代。

2.2 轉基因煙草的耐鹽性測定

煙草在高濃度鹽的脅迫中，葉片都受到損傷而呈現不同程度的黃化、白化，甚至整株死亡。在10天的恢復后從圖3(A)中看出，轉基因煙草的兩個株系(T1－3，T1－4)大部分有新葉生出，而野生型植株全部白化死亡。經過統計轉基因株系T1－3存活率78%，T1－4存活率62%;野生型煙草(WT)全部死亡。這一結果說明轉基因煙草具有耐鹽脅迫的能力。

Fig.3 Salt tolerance in transgenic tobacco plants(A)and survival rate(B)WT，wild－type;T1－3、T1－4，transgenic tobacco lines

2.3 鹽脅迫下轉基因煙草和野生型煙草脯氨酸含量的變化

植物在干旱、鹽脅迫下，與環境形成較高的滲透壓。較高的滲透壓能導致細胞組分的破壞，而滲透調節物質能夠有效抑制滲透脅迫對細胞功能造成的危害［7］。脯氨酸是植物在脅迫下容易積累的一種相容滲透調節劑，它能夠提高細胞內滲透勢、保護細胞蛋白質結構，減少環境脅迫對細胞的傷害［8］。從圖4可看出，轉基因煙草和野生型煙草脯氨酸含量都明顯上升，但是轉基因煙草的中脯氨酸含量的積累明顯高于野生型煙草。鹽脅迫12 d后，轉基因煙草中脯氨酸含量分別是脅迫前的23.75(T1－3)和19.5(T1－4)倍，而野生型煙草中脯氨酸含量只是脅迫前的下的11.6倍，轉基因煙草中脯氨酸含量極顯著高于野生型煙草(P ＜0.01)。

圖4 鹽脅迫對煙草葉片游離脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of salt stress on free proline content of tobacco leaves WT，wild －type;T1 －3、T1 －4，transgenic tobacco lines

2.4 鹽脅迫煙草葉片MDA含量的影響

植物在逆境時，植物器官特別是膜的結構發生變化，功能隨之發生變化，產生大量自由基，使植物產生膜脂過氧化作用。積累的膜脂過氧化物分解的產物為丙二醛(malondialdehyde，MDA)［9］。MDA的積累最終造成細胞膜功能的傷害和植物正常生長受到抑制。因此MDA含量被廣泛認為是膜脂過氧化的指標，表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境反應的強弱［10］。

圖5中，隨著處理時間的延長，煙草MDA的含量呈上升趨勢，但轉基因煙草上升較慢。鹽脅迫處理12天后，轉基因煙草葉片 MDA含量分別增加38.46%(T1－3)和37.04%(T1－4)，分別是非脅迫下的1.38和1.37倍;而野生型煙草葉片增加了108.33% ，是鹽脅迫前的2.08倍;轉基因煙草葉片中 MDA含量明顯低于野生型煙草。這一結果說明，在鹽脅迫下，轉OsSsr1基因煙草膜脂過氧化程度遠低于野生型煙草，維持了植物正常生理代謝、保證轉基因煙草耐鹽的特性。

圖5 鹽脅迫對煙草葉片MDA含量的影響Fig.5 Effects of salt stress on MDA content of tobacco leaves WT，wild －type;T1 －3、T1 －4，transgenic tobacco lines

2.5 鹽脅迫下轉基因煙草和野生型煙草SOD和POD含量的變化

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是細胞內的重要保護酶，能催化超氧陰離子自由基的歧化反應，從而清除超氧陰離子自由基，減少其對膜結構和功能的破壞，該酶的活性與植物的抗逆性密切相關［11，12］。從圖6(A)可以看出:在正常生長條件下，轉基因煙草中SOD的活性略低于野生型煙草，而在鹽脅迫處理后，轉基因煙草和野生型煙草SOD活性升高了，且在處理后第9天達到最大值:野生型煙草SOD活性上升了130.96%，是脅迫前的2.31倍;轉基因的兩個株系分別上升了 303.85%(T1－3)和314.05%(T1 －4)，分別是脅迫前的4.04 和4.14倍。

圖6 鹽脅迫對煙草葉片中SOD(A)和POD(B)活性影響Fig.6 Effects of salt stress on SOD(A)and POD(B)activity of tobacco leaves WT，wild－type;T1－3、T1－4，transgenic tobacco lines

過氧化物酶(peroxidase，POD)是防止膜脂過氧化的主要酶。從圖6(B)中可以看出，鹽脅迫處理前，轉基因煙草和野生型煙草的POD含量基本相同;而隨著脅迫處理時間的延長，盡管兩種煙草的POD含量都呈上升趨勢，但轉基因煙草的POD活性明顯升高更快。處理12天后，野生型煙草POD活性上升290.1%，是脅迫前的3.63倍;兩個轉基因系 POD活性則上升429.43%(T1－3)和380.77%(T1－4)，分別是脅迫前的5.29、4.81 倍。

這些數據說明OsSsr1基因的在煙草中的表達提高了細胞內SOD和POD活性，增強了轉基因煙草清除活性氧的能力。

3 討論

Harpin蛋白編碼基因轉化植物，能夠提高多種植物抗旱性等非生物脅迫耐性［3，13］。本文通過土壤根癌桿菌介導的方法，把從轉hrf1基因水稻的轉錄譜中挑選了一個表達量上調的基因OsSsr1轉入煙草，提高了煙草植株在鹽脅迫下脯氨酸的積累水平和活性氧清除能力，從而增強了轉基因植株的耐鹽性。

脯氨酸的積累既能增加胞內溶質濃度、防止細胞過度脫水，也能與滲透條件下急劇增加的氧自由基發生反應，使之轉變為其他物質，清除活性氧的危害［14］。轉基因煙草與野生型煙草相比，積累的脯氨酸顯著增多，使轉基因株系在鹽脅迫下能夠維持與外界的滲透壓，保護植物細胞的正常功能代謝，抑制滲透脅迫對細胞功能造成的危害。說明OsSsr1基因的表達提高了轉基因株系在鹽脅迫條件下合成滲透調節劑的能力，從而提高了植物的耐鹽性。植物在鹽脅迫下會產生大量的活性氧，活性氧的升高誘發脂質過氧化鏈式反應，破壞生物膜上酶的空間結構及生物膜的通透性，致使細胞死亡［15，16］。逆境條件下產生的活性氧對植物的傷害程度及植物對逆境的抵抗能力與其體內的SOD、POD活性有關，其活性越高，植物的抗逆性越強［17］。本研究中，在鹽脅迫下，轉基因系和野生型煙草體內的MDA含量雖都有不同程度的升高，但轉基因株系體內的MDA的延長積累速率明顯低于野生型。與此相應，轉OsSsr1基因株系在鹽脅迫下SOD和POD活性的升高速率明顯快于野生型植株，說明OsSsr1基因的表達提高了轉基因株系的活性氧清除能力，減緩了鹽脅迫對植物的傷害。

本研究初步證實，OsSsr1基因在煙草中的表達能夠增強煙草植株的耐鹽性，這說明是該基因可能在植物對鹽脅迫的響應中起重要作用，但OsSsr1在植物應對鹽脅迫的信號通路中的具體作用，還需要進一步研究。

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