p53治療白介素-1β誘導兔膝關節炎的實驗研究

尤 欣，王 遷，張 婷，鄭樂婷，唐福林

（中國醫學科學院中國協和醫科大學 北京協和醫院 風濕免疫科，北京 100032）

1999年Sant等學者首次提出以基因傳遞為基礎的滑膜切除或分子溶解方法[3]。即將介導細胞死亡因子或誘導凋亡因子 （如FAS配體等基因）[4]，通過載體，導入病變關節，對增殖的滑膜細胞發揮殺傷作用，從而減輕了RA動物模型的滑膜炎癥。p53是最著名的抑癌基因，如果將野生型p53基因引入RA滑膜細胞，可能會起到基因滑膜切除的作用，具有一定的治療價值。因此，本研究選用p53作為治療因子，以腺病毒（adenovirus，Ad）為載體，以人白細胞介素（interleukin，IL）-1β誘導的兔膝關節炎模型和人RA-FLS為研究對象，探討p53治療炎癥性關節炎的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

Ad-p53由深圳賽百諾公司贈送。動物：新西蘭白兔，6 月齡，2.5～3.0kg，雌性，協和醫院動物室提供。滑膜組織：取自6例做膝關節置換的RA患者滑膜組織。RA的診斷依據美國風濕病學院1982年診斷標準。主要試劑：細胞培養基：高糖DMEM、F-12（美國 Gibco公司）。 胎牛血清（美國Hyclone公司）。RT-PCR反應試劑：TRIzol Reagent（美國 Invitrogen 公司）、Random Hexamers（美 國 Promega 公 司）、M-MLV Reverse Transcriptase（美國 Promega 公司），dNTP、RNasin、TaqDNA polymerase、oligo-dT（bases）、瓊脂糖、溴化乙錠、100bp DNA Ladder（華美生物工程公司）。抗體：p53鼠抗人單克隆抗體（北京中山生物技術公司）。DNA缺口末端標記細胞凋亡檢測試劑盒，R＆D公司。IL-6 ELISA試劑盒：達科為公司。PCR引 物 ：p53（擴 增 產 物620bp）——上 游 ：5’TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA3’， 下 游 ：5’CCACGGATCTGAAGGGTGAAATATTC3’；Tubulin（擴 增 產 物410bp）——上 游 ：5’CTCATCACAGGCAAGGAAGAT3’， 下 游 ：5’TTAAGGTTAGTGTAGGTTGGG3’。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗

復制兔關節炎模型：將MFG-hIL-1β-neo重組體轉染的兔滑膜成纖維細胞系（HIG-82）培養、傳代、篩選陽性細胞后，將3×105細胞分別注入12只兔雙側膝關節。具體方法參考[5]，隨機分組，每組6只兔子。于造模后d5開始治療實驗。治療組：右膝關節注入Ad-p53重組體1×1010，左膝關節注入等體積PBS；對照組：右膝關節注入Ad-LacZ+重組體1×1010，左膝關節注入等體積PBS。評價療效：分別于治療前及治療后d3完成以下檢測：測量膝腫脹關節直徑，計數滑液中白細胞數目。處死兔子后，獲取雙側膝關節滑膜組織，進行HE染色，光鏡下觀察滑膜病理組織學改變。

1.2.2 TUNEL法檢測滑膜組織凋亡情況

按TUNEL試劑盒方法，參見R&D使用說明。熒光顯微鏡下觀察，核仁呈現綠色熒光為染色陽性。

1.2.3 細胞培養和病毒轉染

獲取RA滑膜組織，剪碎，加入膠原酶2mg/ml消化2h，濾過，PBS洗后種植于25cm2培養瓶，加入DMEM培養基+10%FCS，放入CO2孵箱。3～5d后細胞90%融合，用0.25%胰酶消化傳代。于病毒感染前一天接種一定量的細胞，按一定的MOI（10，100）計算所需的病毒量，用PBS稀釋至一定體積。棄去原培養基，沖洗，加入一定體積的稀釋好的病毒液，37℃，CO2孵箱中培養3h，后加入完全培養基。

全力推進重點工程建設。一是完成錦凌水庫、青山水庫、應急入連工程、長海縣引水工程收尾工作；推進猴山水庫、觀音閣水庫輸水等續建項目建設。二是完成清河、湯河水庫加固工程竣工驗收和四道號水庫加固主體工程建設。抓好水閘、水庫除險加固和降等報廢工作。三是開工建設23個中小河流、15個主要支流和獨流入海河流治理項目，治理水土流失面積300萬畝。實施大伙房水庫水源保護區綜合治理工程。四是完成200萬畝節水滴灌主體工程建設。解決120萬農村人口飲水安全問題。改造7座大中型灌區、248座泵站；發放移民直補資金3億元，完成移民項目369個。

四氮唑藍比色法（MTT）檢測細胞活性：MTT工作液（0.5mg/mlMTT in PBS）150μl/孔。流式細胞儀檢測細胞周期：PI染色。

1.2.4 檢測p53蛋白表達和FLS產生IL-6的水平

ELISA法收獲RA-FLS上清，按照達科維公司試劑盒使用說明書操作，檢測IL-6水平。

逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）分析：提取滑膜組織總RNA，定量后逆轉錄，逆轉錄產物進行PCR，微管蛋白Tubulin為內對照。PCR條件：預變性 94℃、5min， 變性 94℃、30s， 退火 64℃、30s，延伸72℃、1min，35次循環，后延伸72℃，10min，4℃保存。2.0%瓊脂糖凝膠電泳。

Western blot：收集 FLS，提取全蛋白，制 12%SDS-PAGE凝膠，上樣，跑膠，電轉至硝酸纖維素膜，封閉，先后加入一抗小鼠抗人p53、二抗羊抗小鼠IgG孵育，洗膜，加ECL顯色，凝膠成像系統掃描成像（FluorChemTMIS-8800，美國 Alpha In-notech公司），分析光密度值。

1.3 統計學方法

統計學處理應用SPSS10.0軟件，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 Ad-p53促進滑膜組織和FLS表達人p53mRNA和蛋白

Ad-p53轉染兔膝關節的滑膜組織，于感染后不同時間提mRNA，逆轉錄后進行PCR分析，發現感染 Ad-p53后 （d1、d2、d3）， 滑膜組織 p53 mRNA表達明顯上調，見圖1。

分別于腺病毒重組體轉染培養的人FLS后0、24h、48h和72h，收集細胞，進行Western blot檢測p53，光飽和度分別為5.6%、11.4%、25.9%和57.1%，提示p53蛋白的表達隨轉染時間延長而增多，具有時間依賴性。見圖2。

2.2 Ad-p53治療兔膝關節炎模型的體內實驗

將 hIL-1β-neo逆轉錄病毒轉染的 3×105HIG-82細胞分別注入兔雙側膝關節，使其生理性表達和分泌hIL-1β，關節炎模型于24h內被成功復制。

Ad-p53治療后的兔膝關節直徑較治療前明顯減小，而注入Ad-LacZ的關節直徑繼續增加，治療組與對照組比較， 差異顯著 （P＜0.05）；Adp53治療組的關節滑液轉變為清亮，滑液量明顯減少，而對照組的滑液仍呈膿性、粘稠、量多。細胞計數顯示：治療組滑液中白細胞數目較對照組明顯減少1～2個數量級，見表1。治療組的關節滑膜未見結節樣增生，滑膜僅僅表現為輕度增厚，而對照組的關節滑膜則多為結節樣增生。注入Ad-LacZ的關節與注入PBS的關節比較，以上關節炎的相關指標基本相同，無明顯差異。

病理組織學分析結果顯示：經Ad-p53治療的滑膜組織較對照組明顯變薄，但厚度不均一，炎癥細胞（中性粒細胞和淋巴細胞）浸潤明顯減少，呈現慢性滑膜炎的改變。行組織TUNEL染色，滑膜邊緣有部分滑膜細胞熒光染色呈弱陽性，未見明顯滑膜細胞凋亡發生（見圖3，封二）。

表1 Ad-p53治療前后hIL-1β誘導的兔膝關節炎相關指標的變化

2.3 p53不能誘導滑膜成纖維細胞凋亡，但能抑制炎癥因子產生

Ad-p53治療hIL-1β誘導兔膝關節炎療效顯著，但TUNEL染色并未明確檢測到細胞凋亡，而且組織學分析顯示大量浸潤的炎癥細胞消失。我們用MTT法測定p53對滑膜細胞生長的影響，圖4示：Ad-LacZ和Ad-p53分別以MOI=10和100去感染FLS，d3獲取細胞，各組間細胞的生長情況無顯著性差異。與對照組比較，無論MOI=10或100，Ad-p53組的FLS未見凋亡或死亡現象。進一步流式細胞儀檢測發現：Ad-p53轉染FLS后d3和d7，細胞生長周期停滯于G1期，均無凋亡峰，證實無凋亡發生。

將正常表達p53（野生型FLS）和過表達p53（Ad-p53轉染的FLS）的滑膜細胞與IL-1β共同孵育24h，收集上清，檢測IL-6的水平，結果顯示野生型FLS產生的IL-6是p53過表達的FLS的5～10倍，提示p53顯著抑制FLS產生IL-6。IL-6是RA等炎癥性關節炎關節局部重要的致炎因子。

3 討論

長期以來，突變p53引起的滑膜細胞凋亡異常被認為是RA的主要發病機制之一。Firestein等學者發現與腫瘤組織相似的p53基因突變，在RA軟骨侵蝕處的滑膜和培養的RA滑膜細胞存在[6]。由于RA滑膜細胞p53基因發生顯性負突變，導致其功能缺陷（Han等）。進一步研究顯示，RA滑膜有標志DNA破壞的微衛星不穩定性存在，可能與DNA錯配修復酶hMSH6的表達下降和hMSH6/hMSH3比例失衡有關，是導致p53等分子發生點突變的原因之一。動物實驗證實，p53-/-小鼠發生Ⅱ型膠原誘導關節炎（CIA）的程度比野生型p53小鼠嚴重，提示p53與RA的發生和發展有關[7]。

我們的研究顯示：p53治療IL-1β誘導的兔膝關節炎效果顯著，滑膜中大量浸潤的炎癥細胞消失，滑液的白細胞計數降低達10倍以上。但滑膜組織和滑膜細胞在p53的作用下并沒有發生細胞凋亡，有趣的是，促炎癥細胞因子IL-6被顯著抑制。IL-6是一個調節炎癥和免疫反應的多功能細胞因子，能促進T輔助細胞（Th）-17和B細胞的分化，在RA炎癥的病理過程中作用重大。臨床試驗證實阻斷IL-6可以有效治療中重度RA，而且對病程久、MTX和TNF拮抗劑無效的難治性RA仍有顯效，不僅降低RA疾病活動性、而且抑制骨破壞和改善患者的生活質量[8]。因此，推測p53很可能通過抑制IL-6等重要促炎癥因子的產生發揮改善滑膜炎癥的作用。

有學者研究急性肺損傷時發現：p53能減輕LPS誘導NF-κB在肺泡上皮細胞的活化，初步揭示了p53與炎性反應的關系[9]。轉入Ad-P53重組體的RA動物模型，不僅滑膜炎明顯改善，而且關節腫脹減輕、滑液中白細胞數目顯著減少，甚至接近正常。FAS配體被稱為死亡因子，利用腺病毒載體將其導入IL-1β誘導的兔關節炎模型，雖然滑膜組織大片脫落，滑膜炎癥顯著減輕，取得了極好的治療效果，但關節軟組織腫脹仍很明顯，滑液中仍有大量的白細胞，數目較治療前變化不大[2]。提示p53與FAS配體的作用機制不同，在短短的3d時間里，炎癥細胞迅速減少，這一現象很難單純用凋亡來解釋。那么，p53是否通過不同的信號傳導途徑影響細胞因子和趨化因子的分泌導致炎癥細胞的撤退或遷移？此假設有待進一步證明。

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