人源性臍帶間充質干細胞移植治療骨關節炎的實驗研究*

陜西省人民醫院骨二科（西安710068）

易 智 劉時璋▲ 史 軍△ 凌 鳴 孫正明 黃向輝 強 輝 聶治軍 時 亮 史紀元

骨性關節炎（OA）是由于關節軟骨發生病變、損毀及骨質增生而導致的慢性關節病。常規的治療方法難以完全治愈，此病因軟骨細胞不能隨意遷移，難以快速的向損傷的位置遷移積聚，軟骨破壞后自然修復的軟骨組織為纖維軟骨而非透明軟骨，缺乏正常透明軟骨的耐用性及特有力學功能［1］。為探討人源性臍帶間充質干細胞（HUCMSCs）關節腔注射治療OA的價值，我們以新西蘭大白兔建立骨關節炎模型，觀察膝關節腔注射HUCMSCs后關節液中IL－1的濃度、軟骨Mankin’s評分、滑膜組織的光鏡和電鏡改變，現報道如下。

材料與方法

1 材 料 45只大耳白兔，雄性，體重2．0～2．5kg。按Vand man方法［2］建立OA模型。隨機分成OA組、干細胞治療組和生理鹽水注射對照組，每組15只。

2 方 法 在實驗設計指導下對各組進行治療處理。OA組及時處死以備用；干細胞治療組注射1×105HUMSCs于關節腔內，每周注射1次，連續注射4周；對照組采用生理鹽水注射，方法與實驗組相同，最后一次注射1周后將全部動物處死。收集試驗動物關節液，用ELISA雙抗夾心法標記所收集關節液中的IL－1β，酶標儀450n m處讀取有色反應的OD值，繪制計算曲線后計算IL－1β濃度值。將動物模型滑膜和股骨髁部軟骨部分取出作為光鏡觀察標本；滑膜使用4%甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋，切片，HE染色后于電鏡下觀察滑膜形態學變化；軟骨標本采用4%多聚甲醛固定，經15%乙二胺四乙酸脫鈣處理10周，包埋后HE染色，光鏡下觀察軟骨形態學變化。對切片進行Mankin’s評分；將所獲得的滑膜立刻置入0．25%戊二醛中做電鏡標本，1%鋨酸固定2h，梯度乙醇及丙西酮脫水，618環氧樹脂包埋，超薄片機切成60n m厚薄片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察。

3 統計學分析 采用SPSS11．0統計軟件，統計數據以均數±標準差表示，采用T檢驗對3組IL－1β濃度平均值、光鏡下滑膜及軟骨 Mankin’s評分進行差異顯著性檢驗，P＜0．05為差異具有統計學意義。

結 果

1 3組關節液中IL－1β濃度比較 干細胞治療組健側（16．37±0．44pg/ml）與 OA 組健側（14．35±0．68pg/ml）以及對照組健側（15．10±0．36pg/ml）比較，差異不顯著（P＞0．367）；干細胞治療組患側（24．33±2．20pg/ml）與 OA 組患側（20．16±1．07pg/ml）以及對照組患側（20．70±1．02pg/ml）比較，兩兩差異不顯著（P＞0．05）。

2 光鏡下滑膜及軟骨Mankin’s評分 見附表。干細胞治療組無論健側還是患側，其關節軟骨及滑膜的Mankin’s評分均低于對照組及OA組，差異顯著（P＜0．05）。

附表 光鏡下滑膜及軟骨進行Mankin’s評分

3 滑膜和股骨髁部軟骨光鏡和電鏡檢測結果在光鏡下OA組、對照組患側可見細胞壞死，干細胞治療組患側鏡下無明顯的病變。由相應的PAS染色可以看出，干細胞治療組患側軟骨染色較淺，OA組著色最深，呈鮮紫紅色。對各組動物滑膜光鏡照片比較研究可以看出，干細胞治療組兩只動物可見炎癥細胞浸潤，其余動物滑膜均未發現炎癥細胞的浸潤。（該炎癥細胞可能為人源性臍帶間充質干細胞）。電鏡檢查可以看出，對照組軟骨細胞核呈卵圓形，細胞表面有細長突起，胞體及包膜較為完整，胞漿內可見許多的細胞器，細胞內有大量粗面內質網，細胞周圍質地松散；OA組軟骨細胞細胞內有大量空泡，外形不規則，細胞周暈消失，核膜不明顯，細胞周圍幾乎未見其它組織結果；干細胞治療組軟骨細胞的各種細胞器豐富，細胞核形態正常，胞質豐富，染色質較均勻，細胞表面突起基本消失，細胞內有大量粗面內質網，胞漿中有空泡出現，細胞周圍質地較為密實。

討 論

骨關節炎是常見的慢性骨關節疾病的一種，多因為骨關節軟骨面骨質增生所致，這種增生具有繼發性和退行性變的特點。臨床表現為關節不能靈活活動和持續的疼痛感，X射線下關節變窄并且會出現囊化變硬，易發生骨折，出現關節內游離物［3］。骨關節炎實非炎癥，由于多出現退行性病變而稱退行性關節炎，具體來說是關節軟骨部分老化提前，尤其是關節部位軟骨的老化。骨關節炎發生意味著關節老化發生，因此骨關節炎在中老年人群中的發病率很高。廣義上講，骨關節炎也包括無菌感染的關節炎疾病［4］。

本實驗利用HUCMSCs在骨關節炎動物模型關節腔內移植來探討骨關節炎治療的新途徑，間充質干細胞是干細胞家族的重要成員之一，干細胞因為有重新分化成其它組織的能力，在器官移植及其它疾病治療中具有非常重要的作用。間充質干細胞是發育早期中胚層和外胚層細胞，最先在骨髓中被發現，其多向分化，造血輔助，免疫調控的特點逐漸被人們發現，無論體內還是體外，間充質干細胞在誘導因素的刺激作用下，可以分化成脂肪、肌肉、骨、韌帶、神經、內皮組織細胞等，因而間充質干細胞可以作為理想的種子，在干細胞移植治療疾病的進程中起到非常重要的作用［5］。

HUCMSCs對兔關節炎模型關節液中IL－1β濃度影響不大，可能與建模均一性較差有關；從光鏡水平上看，在光鏡下OA組、對照組患側可見細胞壞死，干細胞治療組患側鏡下無明顯細胞壞死。各組間有顯著的差異性；同時，從 Mankin’s評分上看，干細胞治療組無論健側還是患側，其關節軟骨及滑膜的Mankin’s評分均低于對照組及OA組；說明HUCMSCs有助于骨關節炎動物模型損傷滑膜、軟骨的修復。而從電鏡檢測結果可以看出，經過干細胞治療，實驗動物軟骨破壞明顯減輕，軟骨組織受到修復。電鏡下未發現細胞融合，實驗動物模型軟骨組織的修復機理可能與移植的間充質干細胞的旁分泌作用有關［6］。本次實驗中模型制作比較成功，但其均一性不是很高，個體差異較大［7］。本實驗以異種異基因人源性臍帶間充質干細胞對動物骨關節炎模型進行干預，從光鏡及電鏡檢查結果無宿主與移植物的相互排斥反應。HUCMSCs的自我更新、多向分化的潛能以及它們所具有的低免疫原性和免疫抑制的作用，為其臨床應用的安全性和有效性提供了可靠的理論依據，同時大大擴展了其臨床適應證的選擇范圍，在骨關節病變的治療領域具有廣闊的前景。

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［5］Wakitan S，Imoto K，Ya manoto T，et al．Hu manautologous culture expanded bone marrow mesenchy mal celltransplantation for repair of cartilage defects in osteoarthriticknees［J］．Osteoarthritis Cartilage，2002，10：199－206．

［6］Lee R H，Ki m B，Choi I，et al．Characterization and expression analysis of mesenchy mal ste m cells fro m hu man bone marrow and adipose tissue［J］．Cell Physiol Bioche m，2004，14（46）：311－324．

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