離子液體雙水相中銅離子與牛血紅蛋白相互作用的研究

王玉鋒，鄧凡政

(淮北師范大學化學與材料科學學院，安徽 淮北 235000)

眾所周知，蛋白質是生命的物質基礎。血紅蛋白是動物及人體內執行輸氧任務的蛋白質，是生命機體進行各種生理活動的主要承擔者。銅是人體和動物組織中必需的微量元素,主要功能是參與氧化還原反應，生物分子中的銅與分子氧直接反應產生自由基[1]。蛋白質某些功能的喪失、激活和維持往往與金屬離子有著密切的關系。離子液體雙水相體系能夠為生物活性分子提供相對溫和的環境而不易使其失活[2]。

作者在此以Cu(Ⅱ)和牛血紅蛋白(BHb)為研究對象，探討了兩者在親水性離子液體1-丁基-3-甲基溴代咪唑([Bmim]Br)和NaH2PO4·2H2O形成的雙水相體系中的相互作用，為生物化學、藥物化學等領域的研究提供理論和應用信息。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

1×10-5mol·L-1BHb溶液，4 ℃保存；1×10-2mol·L-1Cu(Ⅱ)溶液；離子液體[Bmim]Br參照文獻[3]制備；pH值為7.40的Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液，常規方法配制；固體NaH2PO4·2H2O。所用試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

FP-6500型熒光分光光度計，日本分光株式會社；UV-3600型紫外可見近紅外分光光度計，日本島津公司；PHS-3D型酸度計，上海虹益儀器儀表有限公司；XW-80A型漩渦混合器，江蘇海門麒麟醫用儀器廠；超純水系統，上海和泰儀器有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.2 方法

在10 mL刻度比色管中加入1.00 mL緩沖溶液、1.00 mLBHb溶液、不同量的Cu(Ⅱ)溶液和1.50 mL離子液體[Bmim]Br，加水定容至5 mL，再加入2.50 g固體NaH2PO4·2H2O，混勻，在一定溫度下作用15 min后,取上相于另一比色管中稀釋到所需刻度。

以水作參比,用1 cm比色皿測定紫外可見吸收光譜；在激發波長為282 nm、發射與激發狹縫寬度均為10 nm、掃描速率為1000 nm·min-1的條件下測定熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 Cu(Ⅱ)與 BHb作用的熒光猝滅光譜(圖1)

cBHb=1.25×10-6mol·L-1 1～9，cCu(Ⅱ)(×10-4mol·L-1 )：0，1.25，2.50，3.75，6.25，7.50，8.75，10.00，11.25

由圖1可看出，BHb在290～530 nm范圍內有2個發射峰，339 nm為色氨酸和酪氨酸殘基的熒光峰，432 nm可能是類似原卟啉和BSA的熒光峰，反映了卟啉和結合蛋白分子的某種獨特的相互作用[4]。隨著Cu(Ⅱ)的加入，2個熒光發射峰的波長變化不大，但蛋白質的內源熒光強度有規律地降低，說明兩者之間存在著相互作用，發生了熒光猝滅及能量轉移。

熒光猝滅過程通常分為動態猝滅和靜態猝滅。動態猝滅是猝滅劑和熒光物質的激發態分子之間的相互作用引起的，可以用Stern-Volmer方程來描述[5]:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中：F、F0為有、無猝滅劑時BHb的熒光強度；[Q]為猝滅劑Cu(Ⅱ)的濃度；Kq為雙分子猝滅速率常數；τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命，生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s；KSV為Stern-Volmer猝滅常數。

不同溫度下，Cu(Ⅱ)與BHb的Stern-Volmer曲線如圖2所示。

圖2 Cu(Ⅱ)與BHb的Stern-Volmer曲線

由圖2直線的斜率及截距求出不同溫度下作用的KSV等數據見表1。

表1 Cu(Ⅱ)與BHb作用的結合常數和熱力學參數

由表1可知，Kq值大于動態猝滅的Kq值2.0×1010L·mol-1·s-1[6]，且KSV隨著溫度的升高有所降低,由此判斷Cu(Ⅱ)與BHb的熒光猝滅作用不是由擴散和碰撞引起的動態猝滅，而是Cu(Ⅱ)與BHb形成了基態復合物、對BHb內源熒光的猝滅過程，應為靜態猝滅。

2.2 Cu(Ⅱ)與 BHb作用的結合常數、結合位點數及結合力類型

對于靜態猝滅,蛋白質等熒光體與猝滅劑分子之間的相互作用可用Lineweaver-Burk 雙倒數方程進行描述[7]:

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[Q]

(2)

繪制lg[(F0-F)/F]～lg[Q]曲線圖，并由圖計算結合常數Kb、結合位點數n，結果見表1。

由表1可知，溫度升高，結合常數和結合位點數均減小，298 K和310 K下的結合常數分別為4.28×103L·mol-1和3.65×103L·mol-1、結合位點數分別為0.8887和0.8339，說明生成的復合物的穩定性隨溫度的升高而降低，進一步證明Cu(Ⅱ)與BHb的作用是形成復合物的靜態猝滅過程。

當溫度變化不大時，結合反應的焓變ΔHθ可看成一個常數，根據下列熱力學公式求得結合反應的標準吉布斯自由能變ΔGθ、焓變ΔHθ和熵變ΔSθ，見表1。

(3)

ΔGθ=-RTlnK

(4)

ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ

(5)

Ross等[8]研究發現通過小分子與生物大分子作用的熱力學參數可以簡單判斷其相互作用力類型：即氫鍵或范德華力使體系的ΔHθ<0、Sθ<0，疏水作用力使體系的ΔHθ>0、Sθ>0，靜電作用力使體系的ΔHθ≈0、ΔSθ>0。由表1中相關數據得出在離子液體雙水相中，Cu(Ⅱ)與BHb分子間作用力主要是靜電作用力，且是一個放熱、熵增的自發過程。

2.3 Cu(Ⅱ)對BHb構象的影響

同步熒光光譜已用于蛋白質構象變化的分析。Δλ=15 nm時僅表現為酪氨酸殘基的熒光，Δλ=60 nm時則顯示色氨酸殘基的熒光[9]。Cu(Ⅱ)對BHb同步熒光的影響如圖3所示。

cBHb=1.25×10-6mol·L-1 1～6,cCu(Ⅱ)(×10-4mol·L-1 ):0,1.25，3.75，5.00，6.25，8.75

由圖3可知，在實驗條件下，酪氨酸和色氨酸殘基熒光同時被猝滅，相比之下，色氨酸殘基的熒光降低比酪氨酸殘基更顯著，說明Cu(Ⅱ)與BHb的結合位點更接近色氨酸殘基。二者的最大發射波長均未改變，說明Cu(Ⅱ)雖然與BHb發生了作用，但并沒有改變蛋白質疏水腔的疏水環境，對蛋白質的構象影響不大[10]。

2.4 Cu(Ⅱ)與 BHb作用的紫外可見吸收光譜(圖4)

1～5：離子液體下相中BHb，上相中Cu(Ⅱ)、離子液體、BHb、Cu(Ⅱ)與BHb

由圖4可知，在406 nm附近出現的吸收峰為Soret帶，這是氧合血紅蛋白中血紅素輔基與氨基酸殘基間的π-π*躍遷帶[11]；在測定波長范圍，可以看出BHb幾乎完全被萃取到離子液體上相中；在406 nm附近單純Cu(Ⅱ)和離子液體上相的紫外吸光度均較小，而Cu(Ⅱ)的加入可使BHb的吸光度增大，表現為增色效應，說明在雙水相中Cu(Ⅱ)與BHb之間發生了相互作用。

3 結論

運用熒光光譜、紫外可見吸收光譜獲得了Cu(Ⅱ)與BHb的作用信息，采用Stern-Volmer方程和雙倒數方程對所得數據進行處理。結果表明，Cu(Ⅱ)與BHb產生了熒光猝滅作用，且屬于靜態猝滅過程；熱力學參數表明Cu(Ⅱ)與BHb之間的相互作用力類型為靜電作用力；Cu(Ⅱ)與BHb在298 K和310 K下的結合常數分別為4.28×103L·mol-1和3.65×103L·mol-1、結合位點數分別為0.8887和0.8339。同步熒光光譜表明Cu(Ⅱ)雖然與BHb發生了作用，但沒有改變蛋白質疏水腔的疏水環境，對蛋白質的構象影響不大。

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