姜黃素對(duì)大鼠神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)行為學(xué)的影響

王 智，薛榮亮，趙紅霞，高 慧，魏 欣

(1.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710004;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710004)

臨床上常常能遇到腦缺血疾病造成的腦機(jī)能障礙，這主要與腦缺血再灌注損傷以及遲發(fā)性的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)［1］。在腦缺血再灌注損傷機(jī)制中，自由基的過度產(chǎn)生所致的氧化應(yīng)激損傷是其主要原因，因此在腦缺血/再灌注后進(jìn)行抗氧化干預(yù)是減輕腦缺血/再灌注損傷的重要方法。而遲發(fā)性的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與腦缺血/再灌注后隨時(shí)間推移而漸加重的腦機(jī)能障礙密切相關(guān)。如何在缺血/再灌注發(fā)生后早期發(fā)現(xiàn)并且采取有效措施予以干預(yù)，對(duì)臨床改善患者預(yù)后有著極為重要的意義。姜黃素是從姜黃類植物根莖中分離出的一種酚類色素，已有報(bào)道顯示其具有抗氧化、抗炎癥及抗癌等功效［2，3］。近年來有部分文獻(xiàn)指出姜黃素通過清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞壞死從而改善腦缺血及再灌注后的細(xì)胞功能，達(dá)到腦保護(hù)的作用［4，5］。但是其發(fā)揮腦保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不很清楚，而且目前鮮有資料報(bào)道姜黃素對(duì)全腦缺血再灌注后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)行為功能的影響。本試驗(yàn)建立了全腦缺血/再灌注大鼠模型，擬研究姜黃素對(duì)腦缺血敏感區(qū)海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡與大鼠神經(jīng)行為功能的影響，探索討黃素腦保護(hù)機(jī)制，以期為臨床治療腦缺血/再灌注損傷提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠216只，鼠齡55～65日，體重290～310 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。術(shù)前夜禁食，隨意進(jìn)水。姜黃素(購自美國Sigma公司)，原位末端標(biāo)記細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(購自美國 Promega公司)，DAB顯色試劑盒(購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 216只大鼠隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組(SH組)、缺血/再灌注組(IR組)、姜黃素干預(yù)組(CU組)。其中108只用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，108只用于神經(jīng)行為學(xué)試驗(yàn)。每組根據(jù)再灌注后處死(或進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)試驗(yàn))時(shí)間的不同再分為2、6、12、24、48 和72 h 6 個(gè)亞組，每亞組12 只動(dòng)物。

1.2.2 模型制備 采用四血管阻塞法［6］建立SD大鼠全腦缺血再灌注損傷模型。IR組和CU組動(dòng)物予以微動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈5分鐘后松開動(dòng)脈夾以恢復(fù)腦血流。SH組大鼠僅游離暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈及椎動(dòng)脈，不予以凝斷椎動(dòng)脈和夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈處理。SH組和IR組動(dòng)物在全腦缺血再灌注后即時(shí)分別腹腔注射生理鹽水4 ml/kg，CU組動(dòng)物注射依達(dá)拉奉溶液10 mg/kg。

1.2.3 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)法(TUNEL) 按照事先分組選取108只大鼠分別于再灌注后2、6、12、24、48、72 h時(shí)處死。以4%多聚甲醛200 ml心臟灌注處死，取出完整大腦，在視交叉后1 mm和4 mm處各切一刀取中間小塊腦組織(海馬頭端)，將組織塊在4%多聚甲醛液中浸泡，4℃保存3d后制備切片。取海馬冠狀石蠟切片，常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水。蛋白酶K(20 mg/L)室溫消化，用3%過氧化氫一甲醇溶液消除內(nèi)源性辣根過氧化酶活性，加末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)與生物素標(biāo)記的核苷混合物(biotin-11-dUTP)混合反應(yīng)進(jìn)行孵育，再加鏈霉抗生物素蛋白辣根過氧化物酶溶液(streptavidin-HRP溶液)進(jìn)行孵育，用DAB顯色，核呈深棕黃色者為凋亡細(xì)胞，最后復(fù)染、脫水、透明、封片。400倍光鏡下觀察每張切片海馬CA1區(qū)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。定量分析方法為:光鏡下計(jì)算凋亡指數(shù)(Apoptosis Index，AI)。凋亡指數(shù)計(jì)算方法:分別計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè) 為排除麻醉對(duì)大鼠神經(jīng)行為的影響，僅將再灌注后24、48、72 h三個(gè)亞組共54只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其余54只不予處理。①曠場(chǎng)試驗(yàn):也稱自發(fā)活動(dòng)(inner open field test)視頻分析系統(tǒng)，是觀察研究試驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)精神變化，進(jìn)入開闊環(huán)境后的各種行為，例如動(dòng)物對(duì)新開闊環(huán)境的恐懼而主要在周邊區(qū)域活動(dòng)，在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)較少，但動(dòng)物的探究性又促使其產(chǎn)生在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)的動(dòng)機(jī)，也可觀察由此產(chǎn)生的焦慮心理。大鼠曠場(chǎng)反應(yīng)箱高40 cm，底邊長100 cm，四壁及底面涂黑。正上方2 m處設(shè)有數(shù)碼攝像頭，記錄大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)整個(gè)活動(dòng)情況。試驗(yàn)在安靜無外界干擾的情況下進(jìn)行，將大鼠放入曠場(chǎng)反應(yīng)箱底面中心，同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)，觀察時(shí)間根據(jù)試驗(yàn)需要設(shè)定為5 min。觀察指標(biāo)為大鼠中央活動(dòng)時(shí)間比和中央活動(dòng)路程比。觀察結(jié)束后，用10%的酒精清洗反應(yīng)箱的內(nèi)壁以及底面，避免上只大鼠的大小便、氣味等影響下只大鼠的測(cè)試結(jié)果。每只大鼠均按此進(jìn)行試驗(yàn)。②高架十字迷宮試驗(yàn)(EMP):EMP是利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究性和對(duì)高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動(dòng)物的焦慮狀態(tài)。EMP具有一對(duì)開臂和一對(duì)閉臂，齒類動(dòng)物由于嗜暗性會(huì)傾向于在閉臂中活動(dòng)，但是出于好奇心和探究性又會(huì)在開臂中活動(dòng)，在面對(duì)新奇刺激時(shí)，動(dòng)物同時(shí)產(chǎn)生探究的沖動(dòng)和恐懼，這就造成了探究和回避的沖突行為，從而產(chǎn)生焦慮心理。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)安靜，保持在1.5 m處能夠區(qū)分大鼠細(xì)微活動(dòng)的最低亮度，溫度25℃。試驗(yàn)前將大鼠單獨(dú)置于塑料盒中自由探究5 min，后迅速置于高架十字迷宮中央平臺(tái)，頭部正對(duì)一個(gè)開放臂，同時(shí)開始進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)。時(shí)間根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)定為5 min。以大鼠的4個(gè)爪子均進(jìn)入某臂為準(zhǔn)，任意一爪子完全退出則認(rèn)為該次進(jìn)入活動(dòng)完成。觀察指標(biāo)為進(jìn)入開放臂時(shí)間比(OT%)，進(jìn)入開放臂次數(shù)比(OE%)。每只大鼠試驗(yàn)結(jié)束后，以10%的稀釋酒精擦洗各臂和中央平臺(tái)的底面和四周，每只大鼠均按此進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用雙因素析因方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL SH組凋亡指數(shù)較低;IR組凋亡率于缺血再灌注后6 h開始明顯增多，48 h凋亡指數(shù)達(dá)到最高，與SH組比較，IR組凋亡指數(shù)的增高有顯著性差異(P＜0.01);CU組在6 h后各時(shí)點(diǎn)凋亡指數(shù)明顯低于IR組，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1，圖1 ～圖3。

表1 大鼠全腦缺血再灌注后各時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)凋亡指數(shù)比較

圖1 光鏡下缺血再灌注48 h SH組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×400);圖2 光鏡下缺血再灌注48 h IR組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×400);圖3 光鏡下缺血再灌注48 h CU組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

2.2 神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)

2.2.1 曠場(chǎng)試驗(yàn) IR組大鼠曠場(chǎng)中央活動(dòng)時(shí)間比隨缺血/再灌注后時(shí)間推移，逐漸縮短，與SH組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);CU組大鼠曠場(chǎng)中央活動(dòng)時(shí)間比在各時(shí)點(diǎn)較IR組明顯高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。IR組大鼠曠場(chǎng)中央活動(dòng)路程比隨缺血/再灌注后時(shí)間推移，逐漸縮短，與SH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);CU組大鼠曠場(chǎng)中央活動(dòng)路程比在各時(shí)點(diǎn)較IR組明顯高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表2 各時(shí)點(diǎn)大鼠中央活動(dòng)時(shí)間比的比較 (%)

表3 各時(shí)點(diǎn)大鼠中央活動(dòng)路程比的比較 (%)

2.2.2 EMP試驗(yàn) IR組大鼠OE%隨缺血/再灌注后時(shí)間推移，逐漸減少，與SH組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);CU組大鼠OE%在各時(shí)點(diǎn)比IR組明顯高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。IR組大鼠OT%隨缺血再灌注后時(shí)間推移，逐漸縮短，與SH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);CU組大鼠OT%在各時(shí)點(diǎn)比IR組明顯高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表5。

表4 各時(shí)點(diǎn)大鼠OE%比較

表5 各時(shí)點(diǎn)OT%比較

3 討論

在腦缺血再灌注損傷機(jī)制中的興奮性氨基酸釋放、鈣超載、線粒體損傷、自由基和一氧化氮等的大量產(chǎn)生，以及凋亡相關(guān)基因、凋亡蛋白因子和相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)都參與了細(xì)胞凋亡的過程。劉廣義等［7］報(bào)道，鼠腦缺血再灌注后，凋亡細(xì)胞主要位于缺血周圍區(qū)，損傷、壞死細(xì)胞主要位于缺血中心區(qū)，隨著缺血再灌注時(shí)間的延長，缺血周圍區(qū)細(xì)胞損傷、壞死逐漸加重。可見腦細(xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)漸進(jìn)的演變過程，如果能早期積極采取措施保護(hù)尚未凋亡的細(xì)胞，則有可能為臨床治療缺血性腦損傷疾病提供一條新的途徑。

姜黃素是一種安全性很高的植物多酚，其抗脂質(zhì)過氧化、抗自由基損傷作用已得到證實(shí)［8］。姜黃索可抑制自由基生成并加強(qiáng)其清除，抑制缺血再灌注大鼠腦組織脂褐質(zhì)和亞硝酸鹽含量的升高;同時(shí)姜黃素還可影響與氧化、抗氧化有關(guān)的酶類而發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化保護(hù)作用，保護(hù)生物大分子免遭自由基的毒性作用，從而保護(hù)機(jī)體組織器官［9］。石晶等［10］提出姜黃素可能通過其抗氧化作用保護(hù)線粒體的功能，維持細(xì)胞能量代謝，從而增強(qiáng)對(duì)再灌注損傷的抵抗力。

本研究通過建立全腦缺血模型，給予姜黃素腹腔注射后，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，在缺血敏感區(qū)海馬CA1區(qū)，IR組自6 h可以觀察到早期凋亡細(xì)胞，至48 h達(dá)到高峰，一直持續(xù)到72 h。CU組在各個(gè)時(shí)點(diǎn)觀察到的凋亡細(xì)胞均較IR組明顯減少，有顯著性差異(P＜0.01)。由此我們得出結(jié)論，姜黃素對(duì)于腦缺血/再灌注損傷后細(xì)胞凋亡具有明顯抑制作用，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究明確。

研究表明，姜黃素能改善雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎所致的學(xué)習(xí)記憶減退，減少自由基的產(chǎn)生以及減少神經(jīng)細(xì)胞死亡［11］。本研究選用曠場(chǎng)試驗(yàn)和EMP評(píng)估大鼠行為學(xué)改變。曠場(chǎng)試驗(yàn)的中央活動(dòng)路程比和中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間比可以反映大鼠在缺血/再灌注損傷后活動(dòng)性的變化、探究能力和情緒狀態(tài)。在缺血/再灌注損傷后24、48、72 h三個(gè)時(shí)點(diǎn)IR組較SH組大鼠中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間比和中央活動(dòng)路程比明顯減少，CU組較IR組明顯增加，說明姜黃素可以明顯提高大鼠在缺血再灌注損傷后活動(dòng)、探究能力，抑制焦慮情緒。在 EMP中，IR組大鼠較 SH組OE%和 OT%明顯減少，CU組較 IR組 OE%和OT%則明顯增加。OE%和OT%反應(yīng)大鼠的空間探究能力和情緒的敏感性、易激惹性，同樣驗(yàn)證了姜黃素對(duì)全腦缺血再灌注損傷后大鼠行為能力的改善作用。大鼠全腦缺血/再灌注損傷后隨時(shí)間推移，細(xì)胞凋亡逐漸加重，大鼠的運(yùn)動(dòng)能力、空間探索能力降低，焦慮情緒增加。應(yīng)用姜黃素可明顯抑制神經(jīng)元凋亡，在對(duì)腦結(jié)構(gòu)保護(hù)的基礎(chǔ)上，提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力、空間探索能力，緩解焦慮情緒，改善大鼠神經(jīng)行為學(xué)功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦功能的保護(hù)。

總之，通過本次研究得出以下結(jié)論，大鼠全腦缺血/再灌注損傷后應(yīng)用姜黃素可以明顯降低海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率，發(fā)揮腦保護(hù)作用。同時(shí)姜黃素可以顯著改善大鼠全腦缺血/再灌注損傷后大鼠的活動(dòng)性、空間探究能力，抑制焦慮情緒。

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