AGEs通過RAGE促進Jurkat細胞分泌腫瘤壞死因子-α①

游 捷 朱明理 彭 偉 彭雪峰 劉曉紅 劉禮斌

(福建醫科大學協和臨床學院，福建省內分泌研究所，福州350001)

晚期糖化終產物(AGEs)與晚期糖化終產物受體(RAGE)結合導致機體的病理改變在糖尿病加速動脈粥樣硬化進程中起重要作用。動脈粥樣硬化發生發展與免疫炎癥反應密切相關，近年有關T淋巴細胞功能紊亂與動脈粥樣硬化的關系引起人們的重視。氧化低密度脂蛋白、熱休克蛋白等可引起T淋巴細胞活化而啟動免疫反應，在動脈粥樣硬化發病中起重要作用［1，2］。研究表明AGEs和氧化低密度脂蛋白一樣能刺激樹突狀細胞成熟，促進單核巨噬細胞分泌炎癥因子［3，4］。但目前AGEs對T淋巴細胞功能影響的研究還較少。本研究觀察AGEs對Jurkat細胞(CD4+T細胞)表面RAGE表達及分泌炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Jurkat細胞株購于中科院上海細胞庫;RPMI1640培養粉購自Gibco公司;牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma公司;PHA購自Amresco公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、RIPA 裂解液、化學發光檢測試劑盒(ECL)及蛋白濃度測定試劑盒(BCA)購自海門碧云天生物公司;人TNF-αELISA試劑盒購自武漢博士德公司;鼠抗人RAGE單克隆抗體，鼠抗人非特異IgG抗體購自Santa Cruz公司;兔抗人pp38MAPK、p38及pJNK、JNK多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司;兔抗人β-actin抗體及辣根過氧化物酶標記相應二抗購自北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 AGEs制備及細胞培養 按照文獻［5］方法制備AGEs，常規進行熒光測定，內毒素測定。Jurkat細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，在5%CO2、37℃、飽和濕度條件下常規培養，隔天換液。

1.2.2 MTT法檢測細胞存活率 Jurkat細胞以1×105ml-1接種于96孔板，0.25μg/ml PHA預刺激24小時。予不同濃度的 AGEs或 BSA(0、50、100、200 μg/ml)作用24小時，加 MTT(5 mg/ml)10 μl，繼續培養4小時后離心去上清，加二甲亞砜100μl，振蕩10分鐘，酶標儀上以波長490 nm測吸光度。

1.2.3 免疫印跡檢測 RAGE的表達 Jurkat細胞以1×105ml-1接種于6孔板，PHA預刺激24小時。以不同濃度的 AGEs或 BSA(0、50、100、200 μg/ml)作用24小時后收集細胞，提取總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。配平各組蛋白，10%SDS-PAGE，鼠抗人RAGE單抗(1∶500)及兔抗人β-actin單抗(1∶1 000)孵育過夜，辣根過氧化物酶標記相應二抗(1∶1 500)室溫1小時，ECL試劑盒處理，暗室曝光。以Image J軟件分析各組灰度值，結果以目標蛋白除β-actin表示。

1.2.4 ELISA 檢測 TNF-α 的表達 Jurkat細胞以1×105ml-1接種于24孔細胞培養板，PHA預刺激24小時。以不同濃度的 AGEs或 BSA(0、50、100、200μg/ml)作用24小時后收集培養液上清，-80℃保存。同時裂解細胞測總蛋白，平衡各組細胞數。按照ELISA說明書操作檢測上清中TNF-α的濃度，結果以pg/mg表示。

1.2.5 免疫印跡檢測pp38MAPK/p38MAPK、pJNK/JNK Jurkat細胞以1×105ml-1接種于6孔細胞培養板，PHA預刺激24小時。以200μg/ml AGEs作用0、10、20、30、40 分鐘，然后收集細胞，提取總蛋白。Western blot檢測p38MAPK、JNK磷酸化，一抗兔抗人 pp38MAPK，p38MAPK、pJNK ，JNK均為1∶1 000稀釋，鼠抗兔二抗為1∶2 000稀釋，結果以pp38MAPK/p38MAPK、pJNK/JNK表示。

1.2.6 阻斷 RAGE、p38MAPK、JNK 對 TNF-α 的影響 為觀察RAGE在AGEs促進TNF-α表達中的作用，用抗RAGE抗體(1μg/ml)預處理Jurkat細胞1小時，以200μg/ml的AGEs作用24小時后收集培養液上清，-80℃保存。同時設非特異抗體組為對照。另一部分實驗200μg/ml AGEs作用前分別加入p38 MAPK、JNK阻滯劑SB203580(100μmol/L)、SP600125(30μmol/L)預孵育30分鐘。按照ELISA說明書操作檢測上清中TNF-α的濃度，結果以x±s，pg/mg表示。

1.3 統計學處理 每組實驗重復3次，結果以x±s表示，采用SPSS16.0軟件進行統計學分析。常規進行方差齊性檢驗，正態性檢驗，樣本均數間的比較采用t檢驗和方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AGEs對Jurkat細胞存活率的影響 PHA具有刺激淋巴細胞活化分裂的作用，為模擬T細胞活化的雙信號機制，本實驗選用低濃度(0.25μg/ml)PHA提供協同刺激信號。不同濃度的AGEs或BSA(0、50、100、200 μg/ml)作用24 小時，測定各組細胞的吸光度，結果顯示AGEs和BSA對PHA預刺激后的Jurkat細胞的生長無明顯影響(P＞0.05)。

2.2 AGEs對Jurkat細胞RAGE表達的影響 為觀察AGEs對Jurkat細胞表面RAGE表達的影響，我們應用Western blot檢測AGEs作用于PHA預刺激的Jurkat細胞24小時后RAGE蛋白的表達，結果顯示PHA預刺激的 Jurkat細胞表達RAGE，50～200 μg/ml AGEs明顯上調RAGE表達，有濃度依賴關系(P﹤0.05～0.01)。不同濃度的BSA對RAGE蛋白的表達無明顯影響，見圖1。

2.3 AGEs對 Jurkat細胞分泌TNF-α 的影響 不同濃度AGEs或BSA作用于PHA預刺激的Jurkat細胞24小時后，ELISA檢測TNF-α分泌。結果顯示50μg/ml AGEs不影響PHA預刺激的Jurkat細胞分泌 TNF-α，而 100～200 μg/ml AGEs能促進 Jurkat細胞分泌TNF-α，與BSA組比較差異有統計學意義(P ＜0.05 ～0.01)，見圖2。

2.3 AGEs對Jurkat細胞內信號通路的影響 200 μg/ml AGEs與PHA預處理后的Jurkat細胞共培養0～40分鐘后提取總蛋白，Western blot方法檢測p38MAPK、JNK磷酸化與非磷酸化水平的變化。結果表明AGEs作用Jurkat細胞10分鐘就能引起磷酸化p38MAPK表達增高，持續30～40分鐘，40分鐘后p38MAPK磷酸化有所下降，但仍較未刺激前明顯增高。AGEs作用 Jurkat細胞10分鐘后JNK磷酸化水平表達增高，30～40分鐘后JNK磷酸化水平達高峰。在AGEs作用40分鐘內非磷酸化 p38MAPK、JNK水平無明顯改變(P＜0.01，見圖3)。

2.4 阻斷 RAGE、p38MAPK、JNK 對 TNF-α的影響 為觀察RAGE及其胞內信號分子在AGEs促進TNF-α表達中的作用，用抗RAGE抗體(1μg/ml)預處理Jurkat細胞，再加200μg/ml AGEs刺激細胞，結果顯示抗RAGE抗體抑制AGEs刺激的TNF-α的分泌，而非特異抗體對AGEs刺激的TNF-α的分泌無影響。應用p38MAPK、JNK抑制劑能明顯抑制AGEs刺激的 TNF-α 的分泌(P ＜0.01，圖4)。

圖1 Western blot檢測AGEs對Jurkat細胞RAGE表達的影響Fig.1 Effect of AGEs on the expression of RAGE detected by Western blot

圖2 ELISA檢測AGEs對Jurkat細胞TNF-α分泌的影響Fig.2 Effects of AGEs on the secretion of TNF-α detected by ELISA

圖3 Western blot方法檢測AGEs對p38MAPK及JNK磷酸化蛋白表達的影響Fig.3 Effects of AGEs on p38MAPK and JNK phosphorylation detected by Western blot

圖4 抗RAGE抗體、p38 MAPK、JNK抑制劑對AGEs誘導TNF-α分泌的影響Fig.4 Effects of anti-RAGE，inhibitors of p38MAPK ，JNK on the secretion of TNF-αinduced by AGEs

3 討論

已有研究發現RAGE優先表達于小鼠CD44+預激活的記憶池中的初始CD4+T細胞和CD8+T細胞，而CD44-細胞表達較少［6］。我們的研究證實了人CD4+T淋巴細胞Jurkat細胞表達RAGE，隨著AGEs誘導的濃度遞增，RAGE蛋白表達明顯增加。這種配體-受體正反饋調節的現象在多種細胞上有相似的表現，如內皮細胞、神經細胞、樹突狀細胞和單核巨噬細胞等。其原因一方面與核轉錄因子(NF)-кB激活有關，AGEs可活化多種細胞的NF-κB轉錄，而NF-κB對RAGE基因啟動子存在正向調控作用從而可增加RAGE在細胞表面的表達［7］。另一方面，研究認為RAGE是一種類似于Toll樣受體(TLRs)的模式識別受體，內毒素、活性氧、TNF-α等能直接促進RAGE的表達［8］。RAGE和AGEs的其他受體不同，RAGE的作用并非清除體內的AGEs，而是作為傳導AGEs信號的受體分子，介導了細胞對AGEs的大部分應答反應。這個特征使RAGE誘發了一種擴大的炎癥免疫作用，引起細胞的持續活化，在炎癥免疫性疾病中起重要作用。

我們進一步觀察發現AGEs使PHA預刺激的Jurkat細胞分泌TNF-α增加，RAGE抗體干預明顯抑制AGEs誘導的TNF-α的分泌。這個結果說明AGEs對 Jurkat細胞分泌 TNF-α的影響是通過RAGE介導。研究表明RAGE在T細胞正常免疫過程中起重要作用，Dumitriu等［9］用內源性高遷移率蛋白-1刺激抗-CD3和/或抗-CD28抗體預刺激的大鼠脾臟T細胞，可使T細胞大量增殖，表達更多的IFN-γ和IL-12，而抗RAGE抗體可使T細胞增殖和分化能力明顯降低。Moser等［6］把 RAGE+/+或RAGE-/-源的CD4+T細胞轉入同種異體RAGE-/-或RAGE+/+C57BL/6小鼠體內，給小鼠腹腔內注射雞卵清蛋白，發現 RAGE+/+源 CD4+T細胞與RAGE+/+宿主都有利于T細胞的激活與增殖，并且使Th1型細胞因子IL-12和IFN-γ明顯增多。Imani等［10］發現AGEs引起刀豆蛋白預刺激人外周血淋巴細胞粘附增加，并通過細胞表面65 kD的蛋白，促進人外周血淋巴細胞表達更多的IFN-γ。但他們的研究未明確該細胞表面蛋白的性質。我們的研究提示AGEs通過RAGE并促進Jurkat細胞分泌TNF-α增多，可能與糖尿病促進動脈粥樣硬化的形成有關。

還有一個引起我們興趣的發現是，抗RAGE抗體干預顯著抑制AGEs誘導Jurkat細胞分泌TNF-α，提示抑制RAGE的作用可抑制T淋巴細胞免疫功能。其實已有多項研究提示抑制RAGE的作用起到免疫抑制的效果，Dunn等［11］給 IL-10陰性小鼠(慢性結腸炎齲齒類模型)腹腔注射sRAGE(RAGE可溶性片段，可結合RAGE的配體，起抑制RAGE的作用)，6周后發現sRAGE能明顯減少小鼠結腸黏膜下層出現淋巴細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞浸潤，小鼠慢性結腸炎明顯減輕。Yan等［12］發現自身免疫性腦脊髓膜炎小鼠的脊髓高表達RAGE及其配體S100，給小鼠腹腔注射sRAGE或抗RAGE抗體，能明顯減少中樞神經系統炎癥細胞的入侵;對小鼠發病癥狀進行臨床評分，顯示阻斷RAGE使自身免疫性腦脊髓膜炎小鼠的病情明顯減輕。新近研究發現RAGE還參與移植排斥免疫，阻斷RAGE能明顯推遲心臟移植后急性免疫排斥反應［13］。這些研究結果提示抑制RAGE的作用可能與免疫抑制有關，已有動物實驗應用sRAGE或抗RAGE抗體可減少ApoE-/-小鼠動脈硬化的發生和發展，但是否與RAGE的免疫抑制作用有關，值得進一步研究［14］。

細胞因子和絲裂原等均可激活應激調節的蛋白激酶級聯，通過激酶活化基序的磷酸化而活化p38 MAPK和JNK，進而激活NF-κB、AP-1等轉錄因子，調節炎癥介質、炎癥因子等多種基因的表達，參與炎癥反應。Yeh等［15］發現 AGEs和 RAGE結合引起p38 MAPK磷酸化進而活化NF-κB促進人單核細胞(THP-1)表達炎癥因子 TNF-α、IL-1、單核細胞趨化因子-1，與糖尿病血管并發癥的發生與發展有關。Sun 等［16］發現 AGEs可通過 RAGE/p38MAPK/NF-κB途徑引起人內皮祖細胞功能紊亂，促進動脈硬化的形成。研究還發現AGEs通過JNK途徑使樹突狀細胞表面受體RAGE及CD83、CD86、MHCⅡ分子等表達增多，促進樹突狀細胞成熟，進一步提高T淋巴細胞增殖能力、表達更多的炎癥因子IFN-γ、IL-12等，與動脈粥樣硬化的形成有關［3］。本實驗發現AGEs可引起p38MAPK、JNK磷酸化水平明顯增高，表明p38MAPK，JNK途徑已被激活;與 Yeh、Sun的研究一致。推測AGEs與其特異性受體RAGE結合，通過p38MAPK、JNK途徑促進Jurkat細胞分泌炎癥因子，在糖尿病血管病變中起作用。

動物實驗研究證實sRAGE及抗RAGE抗體能阻斷RAGE與配體反應，并在多種炎癥免疫性疾病中起保護作用，但僅局限于細胞和動物實驗，尚未應用于臨床治療。進一步明確RAGE在炎癥免疫性疾病中的作用及其機制，尋找抑制RAGE的措施不但能減少糖尿病并發癥帶來的巨大危害，而且對其它與RAGE有關的慢性腎臟疾病、腫瘤、阿爾茨海默病等疾病防治也有好處。

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