Th17細胞在Graves’病中的變化及意義①

張玉娜 周喜娜 安 杰 朱鐵年 趙瑞景 (河北醫科大學免疫學教研室，石家莊050017)

Graves’病(Graves’disease，GD)是一種以甲狀腺功能亢進和甲狀腺彌漫性增大為特征，并導致全身多系統高代謝表現的器官特異性自身免疫性疾病［1］。流行病學調查顯示，其在普通人群中患病率約為1%，并有逐年增加的趨勢，女性多見。雖然公認其發生與自身免疫有關，但迄今為止GD確切的發病機制仍未完全闡明。本研究通過測定GD患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)接受抗CD3和抗 CD28抗體刺激后其中CD4+IL-17+T(Th17)細胞的數量、培養上清中IL-17 的水平、PBMC 中ROR-γt、IFN-γ 和IL-4 mRNA 的表達，以及甲狀腺組織中IL-17+細胞的分布情況，旨在探討Th17細胞在中國人GD發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 來自于2010年4月至2011年3月在白求恩國際和平醫院內分泌科門診新確診未經任何治療的GD患者30例。其中男8例，女22例，年齡22～45歲，平均33.6歲，病程1周～5年;免疫組化標本來自具有手術指征的6例GD患者手術切除的甲狀腺組織和3例創傷死亡的正常甲狀腺組織。Graves’病診斷標準參照《中國甲狀腺疾病診治指南》(中華醫學會內分泌學會，2008年)。排除其他原因引起的甲狀腺功能亢進及其他自身免疫性疾病。30例健康對照者均來自白求恩國際和平醫院健康體檢的無血緣關系、無甲狀腺疾病家族史的人群，其中男10例，女20例，年齡25～50歲，平均36.1歲。疾病組和對照組在性別、年齡分布上無統計學差異。全部研究對象均簽定知情同意書。該研究已經過白求恩國際和平醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 人淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司;抗人CD4-FITC購自美國Beckman Coulter公司;抗人CD3及CD28抗體、抗人IL-17-PE單克隆抗體、人 IL-17 ELISA試劑盒購自eBioscience公司;兔抗人 IL-17單克隆抗體購自Santa Cruz公司;逆轉錄及Real-time PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司;二步法免疫組化檢測試劑購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 甲狀腺功能檢測 空腹采集2 ml靜脈血，室溫靜置1小時后，1 000 r/min離心5分鐘，留取血清。應用電化學發光法測定血清中促甲狀腺激素(TSH)、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺激素(FT4)、甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)和甲狀腺過氧化酶抗體(TPOAb)的水平。

1.2.2 外周血中Th17細胞數量檢測 空腹采集肝素抗凝外周靜脈血5 ml，迅速分離PBMC，加入抗人CD3 mAb、抗人CD28 mAb(終濃度均為1μg/ml)后放入5%CO2飽和濕度培養箱培養24小時，取2×105個PBMC加入抗人CD4-FITC，室溫避光孵育20分鐘后，破膜后加入IL-17-PE抗體，再次室溫避光孵育20分鐘后，1 500 r/min離心5分鐘，棄上清，細胞沉淀用500μl PBS緩沖液重懸混勻，上流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)檢測，數據采用CellQuest軟件進行分析。

1.2.3 ELISA檢測PBMC培養上清中IL-17的水平 室溫平衡反應試劑30分鐘后，每孔加入100μl樣品稀釋液，標準品孔加入IL-17標準品進行系列稀釋，樣品孔中加入100μl培養上清，室溫避光孵育1小時后，每孔加入50μl Biotin-抗IL-17抗體，室溫避光孵育2小時，洗滌3次，所有孔中均加入Streptavidin-HRP，18～25℃室溫避光孵育1小時，棄上清，洗滌3次后，加入TMB底物溶液，室溫避光孵育5分鐘后終止反應，于450nm測定OD值并計算IL-17含量。

1.2.4 PBMC 中 ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA 的表達收集經抗CD3和抗CD28單抗刺激培養24小時的PBMC，嚴格按照試劑說明提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，加入25μl Real-time PCR反應體系中，檢測 ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA 的相對表達量，人GAPDH作為管家基因。采用Primer Express3.0軟件設計引物序列如下:人ROR-γt:上游引物:5'-CCGATGTGGACTTCGTTTTGA-3';下游引物:5'-CGGTGTGCTGCGGAAACT-3'。人 IFN-γ:上游引物:5'-GAATGTCCAACGCAAAGCAA-3';下游引物:5'-CGACCTCGAAACAGCATCTG-3'。人 IL-4:上游引物:5'-TGTGCTCCGGCAGTTCTACA-3';下游引物:5'-GTCGAGCCGTTTCAGGAATC-3'。擴增條件:預變性95℃ 30秒，然后變性95℃ 5秒，退火延伸60℃30秒，共45個循環。反應結束后根據擴增曲線和溶解曲線判斷反應質量，用2-△△Ct法比較GD患者組和正常對照組間 ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA 表達水平的差異。

1.2.5 免疫組化染色檢測甲狀腺組織中IL-17+細胞的分布 將石蠟包埋的甲狀腺組織切片，脫蠟至水，0.1 mol/L 枸櫞酸(pH6.0)高溫修復抗原 5 分鐘，冷卻至室溫，10%山羊血清37℃封閉1小時后，棄血清，滴加10%山羊血清稀釋的抗人IL-17Ab(1∶100)，濕盒內4℃冰箱過夜，洗滌3次，滴加二抗，濕盒內37℃孵育30分鐘，洗滌，DAB顯色5～10分鐘，自來水終止顯色，復染，封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件分析。計量資料以±s表示，對呈正態分布、方差齊的數據，兩組間差異用兩樣本均數的t檢驗進行比較。不呈正態分布或方差不齊的數據采用Kruskal-Wallis檢驗和Mann-Whitney U檢驗。兩組間采用雙變量相關分析進行相關性檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺功能 收集的30例初發GD組患者血清中TSH濃度降低，甲狀腺激素FT3、FT4和自身抗體TgAb、TPOAb水平升高，符合GD的診斷標準(表1)。

2.2 PBMC中Th17細胞的數量 與正常對照組(11.77 ±4.18)% 比較，初發 GD 組(20.59 ±4.63)%外周血PBMC在經抗CD3和抗CD28刺激培養24小時后，其中Th17細胞占CD4+T細胞的比例明顯升高(P ＜0.01，圖1)。

2.3 PBMC培養上清中IL-17水平 將來自兩組的PBMC經抗CD3和抗CD28刺激培養24小時后，應用ELISA檢測其培養上清中IL-17的水平，初發GD組培養上清中 IL-17 的含量為(83.22 ±34.28)pg/ml，明顯高于正常對照組(19.74 ±5.99)pg/ml(P ＜0.01，圖2)。

表1 初發GD組和正常對照組甲狀腺功能Tab.1 Thyroid function of GD and health control groups

2.4 PBMC 中 ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA 的表達初發GD組PBMC在經抗CD3和抗CD28抗體刺激活化后，ROR-γt mRNA 的表達水平(1.67 ±0.98)與正常對照組(0.92±0.18)比較明顯增高(P＜0.05)。而 IFN-γ mRNA(0.31 ±0.07)、IL-4 mRNA(2.53 ±0.70)均較正常對照組(分別為 0.70 ±0.20和 7.11 ±1.41)明顯降低(P ＜0.01，表 2)。

2.5 初發GD組患者PBMC中Th17細胞百分率與ROR-γt、IFN-γ 和 IL-4 mRNA 表達的相關性分析初發GD組患者，Th17細胞百分率與ROR-γt mRNA表達量呈正相關(r=0.5047，P=0.01);與 IFN-γ mRNA 表達量呈負相關(r=-0.5085，P ＜0.01);與IL-4 mRNA表達量呈負相關(r=-0.5372，P＜0.01)，見圖3。

圖1 外周血中CD4+IL-17+T(Th17)細胞占CD4+T細胞的比例Fig.1 Comparison of CD4+IL-17+T(Th17)proportion between two groups

圖2 初發GD組和正常對照組PBMC培養上清中IL-17水平Fig.2 The level of IL-17 in PBMC culture supernatant from health control and GD patients

表2 初發GD組和正常對照組 PBMC中 ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA表達水平比較(x±s)Tab.2 Comparison of the ROR-γt，IFN-γ，IL-4 mRNA expression in GD and health control groups(±s)

表2 初發GD組和正常對照組 PBMC中 ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA表達水平比較(x±s)Tab.2 Comparison of the ROR-γt，IFN-γ，IL-4 mRNA expression in GD and health control groups(±s)

Note:1)P ＜0.05;2)P ＜0.01 vs control.

IL-4 Control GD Groups ROR-γt IFN-γ 0.92 ±0.18 1.67 ±0.981)0.70 ±0.20 0.31 ±0.072)7.11 ±1.41 2.53 ±0.702)

圖3 初發GD患者CD4+IL17+T(Th17)細胞百分率與ROR-γt、IFN-γ和 IL-4 mRNA 表達相關性分析Fig.3 Correlation analysis between the CD4+IL17+T(Th17)cells proportion and the expression levels of ROR-γt，IFN-γ and IL-4 mRNA in PBMC from patients with GD

圖4 GD組和正常對照組甲狀腺組織HE染色及IL-17的表達(HE，×100;IL-17，×400)Fig.4 H＆E staining and the expression of IL-17 in thyroid gland from healthy controls and GD patients(HE，×100;IL-17，×400)

2.6 甲狀腺組織形態學觀察 手術切除的GD組甲狀腺組織中，濾泡上皮細胞增生，呈高柱狀或立方狀，濾泡腔內的膠質減少或消失，濾泡間可見不同程度的淋巴細胞浸潤(圖4)。免疫組化結果:胞漿中出現棕黃色顆粒者判定為IL-17+細胞。正常對照組未見IL-17+細胞。GD組甲狀腺組織濾泡間質內可見散在的IL-17+細胞(圖4)。

3 討論

傳統觀點認為Th1細胞主要通過分泌IFN-γ等細胞因子介導細胞免疫，Th2細胞則主要通過分泌IL-4等細胞因子介導體液免疫。因為GD主要由自身抗體引起，所以在相當長時間里人們認為GD是由Th2細胞介導的。但隨著對GD患者和小鼠GD模型的深入研究，這一概念遇到了挑戰。近年來的研究發現，許多病人體內的TSAbs屬于IgG1(其產生與Th1亞群相關)［2］。在所有小鼠 GD模型中，Th1和Th2均能引起抗TSHR抗體的產生，而且產生的TSAbs大部分屬于與Th1亞群相關的IgG1。小鼠脾細胞在TSHR抗原的刺激下可分泌Th1類細胞因子如IFN-γ。在用不同方法誘導的小鼠GD模型中，Th1和Th2所起的作用不同，如用表達TSHR和MHCⅡ類分子的纖維母細胞或B細胞誘導的模型中，Th2細胞起著重要作用;而在用質粒、腺病毒、或表達TSHR的樹突狀細胞誘導的模型中，Th1細胞則起著關鍵作用［3］。上述這些有爭議的結果說明GD的發生可能與除Th1和Th2細胞以外的免疫反應有關。

Th17是新近發現主要產生IL-17的另一CD4+T細胞亞群［4，5］。盡管在很長一段時間里 Th1和Th2細胞在許多自身免疫病發生中的作用存在爭議，但近年來許多的研究證實，Th17在許多自身免疫病如多發性硬化、實驗性自身免疫性腦炎(EAE)、碘誘導的非肥胖糖尿病小鼠自身免疫性甲狀腺炎、葡萄膜炎、類風濕性關節炎、重癥肌無力和銀屑病等(這些自身免疫病在以前均被認為是由Th1細胞介導的)的發生中均發揮重要作用［6，7］。Figueroa-Vega等［8］的研究證實，西班牙橋本氏甲狀腺炎病人體內Th17細胞數量明顯增加。Horie［9］與其同事最近的研究發現，IL-17+/+和IL-17-/-BALB/c小鼠發生Graves’病甲狀腺功能亢進的幾率是相同的，而在 NODH2 小鼠，只有 IL-17 小鼠出現Graves’病甲狀腺功能亢進，而IL-17-/-NODH2h4小鼠不發生Graves’病甲狀腺功能亢進，表明Th17在Graves’病甲狀腺功能亢進發生中的作用尚與遺傳背景有關［9］。為此本研究探討了 Th17在中國人GD發生中的作用。

本研究發現，GD病人外周血單個核細胞在抗CD3和抗CD28刺激活化后ROR-γt的表達、分化形成的Th17細胞以及培養上清中IL-17的水平均較正常人明顯增加。ROR-γt作為Th17細胞的特異性核轉錄因子，對Th17細胞的分化、發育和功能起決定性作用［10］。Th17細胞主要通過產生 IL-17(IL-17A)發揮生物學作用，IL-17可增強趨化性細胞因子、IL-1、IL-6、TNF-γ、細胞黏附分子和其他炎癥因子的表達，促進淋巴細胞向炎癥部位遷移［11］。因此，GD病人外周血中產生IL-17的Th17細胞的增加將有助于淋巴細胞向甲狀腺組織浸潤。

淋巴細胞浸潤是自身免疫性甲狀腺疾病的重要特征，我們對GD病人甲狀腺組織的形態學觀察也證實，GD病人甲狀腺組織中有散在的淋巴細胞浸潤。免疫組化結果顯示，在浸潤的淋巴細胞中可見散在的IL-17+細胞(Th17)。

Th1細胞主要通過分泌IFN-γ等細胞因子介導細胞免疫，Th2細胞則主要通過分泌IL-4等細胞因子介導體液免疫。IFN-γ能夠促進自身的表達以及Th1細胞的分化，并抑制Th17細胞的分化。類似的，IL-4能夠促進自身表達以及Th2細胞的分化，且抑制Th17細胞的分化。但IL-17卻不能直接促進Th17細胞分化，也不能抑制Th1細胞、Th2細胞的分化發育。由于 IFN-γ、IL-4抑制 Th17細胞的分化，Th1細胞、Th2細胞可以在一定程度上調節Th17細胞的發育［12］。本研究通過應用qRT-PCR方法，檢測 PBMC 中 ROR-γt、IFN-γ 及 IL-4 mRNA 的表達量，進一步探討CD4+T細胞亞群在Graves'病發病機制中的作用。結果發現初發Graves'病患者組ROR-γt mRNA的表達量顯著增高，而IFN-γmRNA與IL-4 mRNA的表達量均明顯低于正常對照組。相關性分析顯示，初發GD患者組Th17細胞百分率與PBMC中ROR-γt mRNA表達量呈正相關，與PBMC中IFN-γ、IL-4 mRNA表達量均呈負相關。這表明PBMC中的CD4+T在接受刺激活化后核轉錄因子ROR-γt表達增多誘導其向Th17細胞分化發育，同時也證明IFN-γ、IL-4細胞因子抑制Th17細胞的分化，或者說Th1細胞、Th2細胞拮抗Th17細胞的分化。由于機體內CD4+T細胞各亞群的發育、分化及調節之間存在著錯綜復雜的關系，與之相關的細胞因子網絡關系亦尚未完全明確。我們以前的研究曾發現，GD病人PBMC中與CD4+CD25+調節性T細胞發育及功能相關的Foxp3和TGF-γmRNA表達明顯降低［13］，提示調節性T細胞的功能缺陷在GD的發生中可能也起一定的作用，因此，有關GD發生的詳細免疫學作用機制尚需進一步深入研究。

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