自體DC-CIK細胞聯合培美曲塞治療老年非小細胞肺癌的療效與安全性①

彭大為 李建旺 元建華 劉英平 于偉玲 孟 娟 羅 潔

(海口市人民醫院(中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院)腫瘤科，海口570208)

非小細胞肺癌(NSCLC)在肺癌患者中占80%～85%，30%患者可行手術治療［1］。約70% ～80%的患者發現時已屬中晚期。美國報道，肺癌確診時，50%已超過65歲，30%超過70歲。意大利報道65歲以上的肺癌病人占60%以上。我國肺癌發病年齡自40歲開始上升，發病及死亡高峰均在75歲左右。70歲以上的老年患者構成一組特殊的龐大的NSCLC人群，其治療對策成為臨床研究的重要內容。體內回輸免疫活性細胞的過繼免疫療法是繼手術、化療、放療之外的另一種重要的腫瘤治療方法。樹突細胞(DC)識別病原，激活獲得性免疫系統，殺傷細胞(CIK細胞)通過發揮自身細胞毒性和分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞，二者聯合確保了一個高效和諧的免疫反應的完成。2008年9月26日美國食品藥品監督局批準培美曲塞(Pemetrexed disodium，PEM)聯合順鉑作為NSCLC的一線藥物，適用于ⅢB/Ⅳ期非鱗癌。我們通過采用DC/CIK聯合培美曲塞二鈉或培美曲塞二鈉單藥治療47例老年中晚期NSCLC，觀察其療效和不良反應。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院腫瘤科自2009年1月至2011年6月經病理組織學或細胞學檢查確診，且均經X線、CT等檢查有明確病灶的ⅢA～Ⅳ期初診肺腺癌患者47例，KPS評分70～90分。其中男性29例，女性18例;年齡65～79歲，中位年齡71歲，75歲以上4例;臨床分期:ⅢA期8例，ⅢB期24例，Ⅳ期15例。47例患者隨機分為聯合治療組:DC/CIK聯合培美曲塞二鈉(n=24)和單純化療組:培美曲塞二鈉(n=23)單藥治療。所有病例在接受藥物治療前，均未接受化療及放療，兩組年齡、病理類型、臨床分期等無顯著性差異。

1.2 治療方法

1.2.1 DC、CIK細胞的培養和擴增 患者入院后行X線、CT檢查。根據X線、CT確定腫瘤大小，計算出腫瘤體積。采血前24小時應用GM-CSF行外周血干細胞動員，經CS-3000血細胞分離機分別采集患者的外周血5L中的新鮮抗凝外周血單核細胞(PBMNC)，再用聚蔗糖400(中國科學院生物物理研究所)分離后經Hank's液洗3次，收集純度在90%以上的外周血單個核細胞，調整濃度為1×106L-1。第一天加rh-干擾素γ1 000 U/ml，第2天開始加入抗CD3單抗 50μg/ml，IL-1a 100 U/ml，IL-2 1 000 U/ml，連續培養3天，更換含有上述因子的培養液1次，連續培養10～20天，每周2次測定白細胞增殖率和 CD3、CD56陽性細胞率，然后以DC∶CIK=1∶3比例和CIK細胞混合，用CIK培養液培養產生DC-CIK細胞。用臺盼藍拒染法計數，動態觀察DC共培養物的表型變化，分別于細胞培養的第9天檢測DC表面標記CD40、CD80、HLA-DR和第9、14天檢測CIK和DC-CIK共培養物表面標記CD3、CD56、CD4、CD8。當細胞數擴增陽性目標值達到85%及以上時進行細胞治療。

1.2.2 培美曲塞二鈉組治療方法 培美曲塞二鈉(江蘇豪森有限公司生產，商品名普來樂)500 mg/m2，靜脈滴入超過10分鐘，1天，21天為1個周期;培美曲塞二鈉使用前1周開始每日口服葉酸400μg，直到培美曲塞二鈉治療結束后3周;培美曲塞二鈉使用前1周開始，每3個化療周期肌肉注射一次維生素B12 1 000μg;培美曲塞使用前24小時口服地塞米松4 mg，2次/天，連服3天。

1.2.3 DC/CIK聯合培美曲塞二鈉治療方法 患者行PBMNC采集后，行培美曲塞二鈉治療。采集后經實驗室培養2周左右，進行回輸DC細胞及CIK細胞，2～3次/周，一次回輸 DC細胞1×109～1×1010，CIK 1×1010～2×1012。每隔1個月重復治療1周期。

兩組化療前均常規給予5-HT3受體拮抗劑等預防嘔吐，化療期間監測血常規，出現Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制時給予粒細胞集落刺激因子，化療過程配合支持治療。入選患者至少接受2個周期以上化療，最多接受6個周期化療。

1.3 療效評價 療效評價采用螺旋CT增強掃描，每2個周期進行評價，依據實體瘤療效評價標準(RECIST)進行療效評價，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩定(SD)和進展(PD)，臨床獲益率CR+PR+SD。不良反應依據美國國立癌癥研究所常見毒性標準(CTC310)進行評價。生存質量評價根據患者Karnofsky評分和體質量;中位生存時間(MST)定義為半數患者經歷死亡或末次隨診時間。生存期為治療開始至死亡或末次隨診的時間。隨訪截止時間是2011年12月。

1.4 統計學處理 應用SPSS15.0軟件進行統計學分析。兩組間療效、1年生存率及不良反應發生率比較用χ2檢驗;兩組間中位生存時間比較用 Log-Rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIK和DC-CIK培養結果 CIK和DC-CIK共培養的增殖活性細胞因子誘導的CIK細胞均明顯增殖，而DC-CIK共培養細胞具有更高的增殖活性。細胞在第3天后開始增殖，第5～6天快速增長，培養20天時，CIK細胞和 DC-CIK共培養的細胞增殖倍數分別為120和1 000。CIK對Bel-7404細胞的細胞毒活性為46.8%。

2.2 免疫治療前后患者外周血免疫學指標變化聯合治療組患者治療后外周血CD3+CD8+雙陽性細胞的比例升高(P＜0.05)，CD3+CD56+雙陽性細胞的比例大幅升高(P＜0.01);單純組患者治療后外周血CD3+CD8+、CD3+CD56+雙陽性細胞的比例無明顯變化(P＞0.05)。兩組間比較差異有顯著統計學意義(P ＜0.01，表1)。

2.3 療效觀察 患者經1個療程 DC-CIK靜脈回輸治療后自覺癥狀改善，食欲增強，睡眠改善，疼痛減輕，體質量無明顯下降，體力較前好轉，培美曲塞治療的毒副反應減輕。聯合治療組和單純化療組臨床獲益率分別是 66.67%和 56.52%(P ＜0.05，見表 2)，中位生存期分別是 9.3 個月和8.7 個月(P ＞0.05)，1 年生存率分別是27.6%和 25.4%(P ＞0.05)。

2.4 兩組患者治療的不良反應 依據美國國立癌癥研究所制定的通用藥物毒性反應標準，化療期間兩組患者均出現Ⅰ～Ⅱ度骨髓抑制及消化道反應。在聯合治療組患者接受免疫治療過程中，并未出現Ⅲ度以上嚴重不良反應。回輸后常見的不良反應(7例)為發熱，多數可自行消退，1例采用解熱鎮痛藥。1例出現過性寒戰，肌注異丙嗪后緩解。兩組主要的不良反應是骨髓抑制和胃腸道反應以及乏力，其中聯合治療組中性粒細胞降低發生率明顯低于單純化療組(Ⅰ ～Ⅱ度:9.05%vs 19.09%，P＜0.05)，Ⅲ ～ Ⅳ度:2.52%vs 9.27%，P ＜0.05);聯合治療組胃腸道反應發生率也明顯低于單純化療組(Ⅰ ～ Ⅱ度:6.29%vs 15.09%，P ＜0.05;Ⅲ ～ Ⅳ度:2.76%vs 8.91%，P ＜0.05)。

2.5 治療前后患者的臨床受益反應變化 聯合治療組患者治療前KPS評分80分者5例，70分者12例，60分者7例;治療后顯效9例，有效9例，總有效率75%。單純化療組患者治療前KPS評分80分者6例，70分者10例，60分者7例;治療后顯效4例，有效7例，總有效率52.2%。聯合治療組治療有效率高于單純化療組(P＜0.05)。聯合治療組治療前 KPS 評分70.2 ±5.8，治療后 79.1 ±9.3，較治療前升高(P＜0.05)，單純化療組治療前KPS評分71.5 ±7.5，治療后72.8 ±10.5，較治療前無明顯變化(P＞0.05)。兩組間比較差異有顯著統計學意義(P ＜0.01，表3)。

表1 兩組患者治療前后血清腫瘤標志物變化的比較Tab.1 Comparison of the serum tumor markers before and after the therapy in 2 groups

表2 聯合治療組和單純化療組療效對比Tab.2 Comparison of therapeutic effect between combination therapy group and chemotherapy group

表3 兩組患者治療前后的臨床受益反應比較Tab.3 Comparison of the clinical benefit response before and after the therapy in 2 groups

3 討論

晚期非小細胞肺癌常用含鉑類的聯合化療，有效率在30% ～50%［2］。并且，年齡的增加意味著患者骨髓儲備功能降低，藥物的清除能力降低，老年患者的整體化療耐受性差，因此選擇安全高效的化療方案一直是腫瘤科醫師的研究方向。目前，鉑類藥物聯合第三代化療藥物已成為晚期NSCLC患者的標準一線治療方案，但是在總有效率、1年生存時間等方面仍然不盡如人意，而且其不良反應如血小板減少、貧血較多，影響了患者的依從性［3］。培美曲塞(Pemetrexed)是一種多靶點葉酸拮抗劑，其作用機制主要是通過抑制胸苷酸合成酶(Thymidylate synthetase，TS)二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)和甘氨酸核糖核苷甲酰基轉移酶(Glycinamide ribonucleotide formyl transferase，GARFT)從而阻斷嘌呤和嘧啶合成使細胞分裂停止于S期抑制腫瘤細胞的生長［4］，2004年美國 FDA批準培美曲塞用于晚期NSCLC的二線治療。2008年9月26日美國食品藥品監督局批準培美曲塞聯合順鉑作為NSCLC的一線藥物，適用于ⅢB/Ⅳ期非鱗癌。

Bearz等［5］于2008年報道了一項Ⅲ期臨床研究，培美曲塞二鈉二線治療160例老年肺癌患者，有效率40%，中位生存期12個月，較先前報道更有效，同時中性粒細胞下降、發熱等不良反應也顯著降低。2009年的ASCO會議上，禮來公司公布了力比泰(注射用培美曲塞二鈉)在663例受試者應用的臨床試驗結果，該試驗證實力比泰作為維持療法藥物時，可以延長患者的總體生存期，在非鱗癌受試者當中，力比泰受試組平均生存期可長達15.5個月，而安慰劑對照組僅為10.3個月。試驗證實，老年肺癌患者如果PS評分較好，化療較維持治療能顯著延長生存期和改善生活質量［6］。Grnberg［7］報道培美曲塞治療效果好，且毒副反應輕而被與鉑類藥物聯合應用于晚期NSCLC的一線治療。另外，培美曲塞對于晚期NSCLC的療效與NSCLC的病理類型相關，培美曲塞可顯著性提高腺癌及大細胞肺癌的生存率，可能與腺癌患者胸苷酸合成酶(TS)的表達水平顯著低于鱗癌患者，使得葉酸代謝被培美曲塞更好地抑制有關［8］。

DC是目前為止發現的人體最有效的抗原提呈細胞(APC)之一。APC與T細胞之間的相互作用所誘發的免疫應答是免疫抑瘤效應的中心環節。DC在大多數組織體內以未成熟狀態存在，不能直接刺激T細胞，但具有特殊的捕獲和加工抗原的能力。腫瘤細胞表面缺乏MHC和共刺激分子，無法激活T細胞免疫，是腫瘤免疫逃逸的重要機制［9］。DC與CIK共培養后產生的細胞群體比同原CIK細胞具有更強的增殖活性。CIK與DC相結合，不僅提高了CIK細胞的細胞毒作用，也能顯著提高DC的功能［10］，DC與CIK混合培養時，兩者能相互調節而增加細胞因子釋放和增強細胞毒性，顯著提高CIK細胞的增殖能力和殺傷活性，臨床治療效果優于CIK等其他效應細胞。體內外實驗研究均表明DC能誘導腫瘤宿主對特異性抗原的免疫應答，提高腫瘤宿主免疫效應細胞的抗病毒活性［11］。CIK同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優點。CIK細胞能分泌多種細胞因子(如IL-4、IFN-α 等)，且具有比 LAK、CD3AK 細胞更強的殺傷活性［12］。國內外的臨床研究表明，一般在放療、化療后間隔2～4周，在機體免疫力有所恢復時，輸入CIK細胞，可提高腫瘤患者的緩解率，并在清除微小殘留病灶方面發揮重要作用［13］。

本研究中，47例患者均完成2個周期以上化療且可評價療效，兩組患者療效均較好，但聯合治療組具有更好的臨床獲益及更少的不良反應，并且具有更高的生存質量。研究結果表明，自體CIK細胞及DC細胞聯合培美曲塞治療老年中晚期NSCLC療效較好，不良反應輕，可作為老年中晚期NSCLC一線治療的選擇之一。但由于本研究病例數較少，尚需擴大病例進一步證實。

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