FK506作為佐劑刺激Tfh細胞增強體液免疫水平的研究①

張婧瑤 黃波波 高文娟 楊司韻 孫昕然 張一雪 康友敏

(中國農業大學生物學院農業生物技術國家重點實驗室，北京100193)

Th細胞在免疫反應中起到重要的調節和輔助作用。Th細胞的前體細胞在不同抗原、共刺激分子、細胞因子等促進分化的因素作用下，分化為不同類型的Th細胞而發揮作用。目前已知的有Th1、Th2、Th17、Treg、Th9、Tfh 等幾個亞群［1］。其中 Tfh是近年來發現的一群輔助B細胞的主要T細胞亞群，而Th1和Th2所分泌的細胞因子在B細胞活化和Ig類別轉換中只起到調節的作用［2］。Tfh細胞表達的CD40L和ICOS與B細胞上的CD40和ICOSL結合，以及通過分泌IL-21，在刺激B細胞的增殖、分化以及免疫球蛋白類別的轉換中起著十分重要的作用［3，4］。IL-21在很大程度上加強了由 CD40與其配體CD40L結合誘導的B細胞的增殖，還調節Ig的生成及同型轉換［5］。Tfh細胞還表達CXCR5，使它在CXCL13的趨化下，被募集到淋巴濾泡并與B細胞共定位和相互作用。因此，CXCR5成為Tfh遷移、定位重要的“轉運分子”，也是Tfh細胞重要的表面標志。目前研究認為Bcl-6是可能控制初始T細胞分化為Tfh的轉錄因子［6］。因此Tfh細胞相關分子(如ICOS或IL-21)的表達高低很可能與某些自身免疫性疾病或免疫缺陷疾病的發病有關［7］。

他克莫司(Tacrolimus)，又名FK506，大環內酯類物質，是繼環孢菌素A(CyclosporinA，CsA)之后國內外器官移植術后臨床常規使用的新型免疫抑制劑之一［8］。FK506主要是與細胞性蛋白質(FKBP12)結合，復合物與神經鈣調磷酸酶特異性結合以抑制其活性，從而阻滯T淋巴細胞激活過程。FK506也可抑制IL-2、IL-3及IFN-β等淋巴因子的生成及IL-2受體的表達［9］。FK506對于Th細胞的研究多集中于二十世紀八十年代左右，而對于新近發現的Th細胞亞群研究很少。我們的前期研究發現FK506能夠抑制Th17而刺激誘導調節性T細胞(Treg)的產生，FK506對于Tfh細胞亞群研究還未見報道［10，11］。本文利用 FK506 作為卵清白蛋白(OVA)的佐劑對其刺激Tfh細胞增強體液免疫反應的機制進行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物免疫 雌性BALB/c小鼠(購于中國醫學科學院實驗動物研究所)，6～8周齡，每組4只。OVA為Sigma產品。每只小鼠皮下注射OVA 100 μg，FK506(Astellas Ireland Co.，Ltd)10 μg，免疫三次，間隔2周。實驗有3批小鼠按分組分別進行免疫。

1.2 ELISA 在第三次免疫后7天，收集不同組小鼠血清進行常規的ELISA檢測。具體方法如下，用5μg/ml OVA蛋白包被96孔酶標板，4℃過夜;洗滌后用含5%脫脂牛奶封閉1小時;洗滌后加入不同稀釋倍數的小鼠血清，37℃孵育1小時;洗滌后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG酶標二抗，37℃孵育1小時;洗滌后 TMB顯色，酶標儀OD450 nm/OD620 nm測定每孔光密度值。實驗組血清與陰性對照OD比值大于等于2為陽性，此時的稀釋倍數即為抗體滴度。

1.3 細胞表面及細胞因子胞內染色 在第三次免疫后7天，取小鼠脾臟，制備成單細胞懸液，裂解紅細胞后，利用細胞因子胞內染色的方法，1×106細胞加入PMA 50μg/ml和離子霉素100 ng/ml，同時加入莫能霉素(Golgisop產品)于37℃、5%CO2培養箱培養4小時，利用4%多聚甲醛固定，0.1%的皂素破膜后，加入熒光標記的抗小鼠CD4、CXCR5、IL-21的單克隆抗體(購于ebioscience)進行染色，流式細胞儀檢測Tfh細胞(CD4+CXCR5+)及分泌IL-21的Tfh細胞(CD4+CXCR5+IL-21+)比例。同時取樣品利用抗小鼠B220和IL-21R熒光標記單克隆抗體(購于ebioscience)進行染色，檢測B細胞表達IL-21R(B220+IL-21R+)情況，結果以 B220+IL-21R+細胞占B220+細胞比例進行統計分析。

每批免疫小鼠各有1只，在第三次免疫后90天，取小鼠脾臟，制備成單細胞懸液，裂解紅細胞后，加入熒光標記的抗小鼠B220、CD27的單克隆抗體(購于 ebioscience)進行染色、流式細胞儀檢測，B220+CD27+B細胞即為記憶性B細胞。

1.4 統計學處理 實驗結果用t檢驗進行統計學分析，P＜0.05差異顯著，P＜0.01差異極顯著。

2 結果

2.1 FK506作為佐劑顯著增強抗體水平 利用FK506/OVA免疫小鼠三次，間隔2周。第三次免疫后7天，收集不同組小鼠血清進行ELISA檢測血清中IgG水平。結果如圖1所示，FK506/OVA免疫組IgG滴度最高為32 000，OVA單獨免疫組IgG滴度為16 000，表明FK506作為佐劑能夠顯著增強OVA特異性的抗體水平。

2.2 FK506作為佐劑刺激Tfh細胞產生IL-21 利用FK506/OVA免疫小鼠三次，間隔2周。第三次免疫后7天，制備脾臟單細胞懸液進行胞內細胞因子抗體染色，利用流式細胞儀檢測CD4+CXCR5+細胞及CD4+CXCR5+IL-21+的比例，結果如圖2所示，FK506/OVA免疫組CD4+CXCR5+細胞的比例最高為 10.3%，顯著高于 OVA單獨免疫組(5.5%)。如圖3所示，FK506/OVA免疫組 CD4+CXCR5+IL-21+細胞的比例最高為10.2%，顯著高于OVA單獨免疫組(6.1%)。表明 FK506作為OVA的佐劑能夠增加Tfh細胞及其分泌的IL-21，可能直接作用于B細胞。

圖1 FK506對小鼠抗體水平的影響Fig.1 FK506 increased IgG level

圖2 FK506誘導Tfh細胞產生Fig.2 The induction of Tfh cells by FK506

圖3 FK506刺激Tfh分泌IL-21Fig.3 FK506 stimulated IL-21 expression of Tfh cells

2.3 FK506作為佐劑對B細胞表達IL-21R的影響 Tfh細胞可以分泌IL-21，通過與B細胞表面的IL-21R作用刺激B細胞的增殖及活化，增強體液免疫水平。免疫后的小鼠取脾臟細胞進行B細胞表面IL-21R的表達的檢測。如圖4結果表明FK506/OVA組B220+IL-21R+顯著高于OVA單獨免疫組，表明FK506可以增加B細胞表面IL-21R的表達。

2.4 FK506對記憶性B細胞的影響 B細胞被激活后轉化為漿細胞分泌抗體，而后大部分細胞凋亡，有一小部分B細胞會轉化為記憶性B細胞，待再次遇到抗原后此部分記憶性B細胞很快被活化并分泌抗體。因此我們對FK506對記憶性B細胞的影響進行了檢測。B220分子是B細胞的標志，CD27+是記憶性B細胞的特征標記，B220+CD27+B細胞即為記憶性B細胞。結果如圖5所示，FK506/OVA組與OVA組相比，B220+CD27+表達顯著上升，表明FK506能夠增加記憶性B細胞的比例。

圖4 FK506增加B細胞表達IL-21RFig.4 FK506 increased IL-21R expression of B cells

圖5 FK506對記憶性B細胞的影響Fig.5 FK506 increased the percentage of B cells

3 討論

FK506是抑制機體免疫反應的藥物，主要應用于器官移植排斥反應、自身免疫性疾病及過敏反應的治療［12，13］。FK506對 T 細胞的抑制作用主要是通過抑制IL-2的產生，即抑制Th1細胞亞群;我們的前期研究發現FK506能夠影響Th17的產生及Treg細胞的產生和功能［10，11］。FK506 對于 Tfh 細胞亞群研究還未見報道。本研究通過利用FK506作為模式OVA蛋白的佐劑，首次發現FK506能夠增加Tfh細胞亞群的比例并刺激IL-21的分泌，同時B細胞表面IL-21R表達顯著升高，表明Tfh細胞可能通過IL-21作用于B細胞，進而增強B細胞的增殖能力及分泌抗體的水平。

疫苗免疫能夠刺激機體產生具有抗原專一性的免疫反應，是預防和治療疾病的重要和有效途徑。疫苗免疫能夠產生免疫記憶細胞，再次遇到抗原將會在短時間內大量的擴增特異性的免疫細胞，重要的是疫苗免疫能夠產生抗原特異性的免疫記憶細胞。本研究首次利用FK506作為模式OVA蛋白的佐劑，發現FK506能夠增強記憶性B細胞的比例，進而增強疫苗的體液免疫水平。

綜上所述，FK506作為蛋白疫苗佐劑能夠刺激Tfh細胞分泌IL-21，作用于B細胞表面的IL-21R，刺激B細胞的增殖及活化，增強抗體水平，本研究為FK506研究拓展了思路。

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