雙特異性重組腺病毒Ad-HT對肝癌細胞的體內、外抑制效應①

劉廣臣 孫大輝 齊延新 王金輝 王卓越 吳 娜 樸秉國 金寧一 李 霄

(吉林大學第一臨床醫院創傷骨科，長春130021)

自上個世紀50年代Caslary發現新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)爆發流行使晚期胃癌患者的轉移灶受到有效抑制以來，NDV的抗腫瘤作用開始被人們重視，相應的科研以及臨床研究開始發展起來［1-3］。研究發現，NDV最主要的表面結構血凝素-神經氨酸酶(Hemagglutinin-neuramidinase，HN)可作為受體發揮類似于流感病毒的神經氨酸酶活性(Neuramidinase activity，NA)裂解唾液酸物質以暴露腫瘤細胞表面信號識別位點和表面抗原，HN基因還可誘導樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)等外周血單核細胞(Peripheral blood monouclear cells，PBMC)釋放大量 α 干擾素(Interferon-α，IFN-α)，釋放量比其他細胞高1 000倍左右，并具有如活化巨噬細胞、自然殺傷細胞和穩定活化T細胞的作用［4］。除此之外，目前已證實HN蛋白可作為糖蛋白在細胞膜表面形成獨特的識別部位，通過激活機體免疫發揮對腫瘤細胞的殺傷功能。由此可見，HN基因在腫瘤基因治療領域具有潛在的巨大的應用前景。本課題組利用人端粒酶反轉錄酶啟動子(Human telomerase reverse transcriptase promoter，hTERTp)、人 2 型腺病毒復制必需基因E1a和HN基因制備了具有腫瘤特異性殺傷和腫瘤特異性復制功能的雙特異抗腫瘤重組腺病毒Ad-HT，并針對人肺癌、人胃癌和人直腸癌等腫瘤細胞結合人胚肺、人肺肝等正常細胞證明了其特異性［5，6］。本研究旨在利用 Ad-HT探討其對肝癌細胞的體內、外抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 重組腺病毒 Ad-HT、Ad-HN、Ad-GT和Ad-EGFP由本室構建、鑒定并保存［7］;人肝癌細胞BEL-7402和小鼠肝癌細胞H22由本室保存;噻唑蘭(3-［4，5-dimethylthiazol-2-yl］-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)、吖啶橙(Acridine orange，AO)、溴化乙啶(Ethidium bromide，EB)、二脒基苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)和羅丹明 123(rhodamine 123，Rho 123)和 2，7-二氯熒光素二乙酸乙酯(2，7-Dichloro Fluorescin Diacetate，DCFA)購自Sigma公司;RPMI1640細胞培養液和胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)購自 Invitrogen公司;蛋白提取試劑盒、BCA檢測試劑盒、Annexin V檢測試劑盒和Caspase檢測試劑盒購自Beyotime公司;C57BL/6小鼠購自軍事醫學科學院實驗動物中心;其它試劑均為國產分析純。

1.2 MTT檢測［8］于96孔細胞培養板內制備BEL-7402單層細胞(5×103)，分別用 Ad-HT、Ad-HN、Ad-GT和 Ad-EGFP進行感染(設未感染對照孔)，每種病毒采用3個感染復數(Multiplicity of infection，MOI)劑量(100 MOI、10 MOI和 1 MOI，每個劑量設3 個復孔)。分別于感染 12、24、36、48、60、72小時后加入20μl/孔 MTT(5 mg/ml)，繼續培養4小時后棄培養液并加入200μl/孔 DMSO，收集溶液并利用酶聯免疫檢測儀于490 nm波長檢測吸光值(A)。并利用如下公式計算:細胞殺傷率=(對照孔A值—實驗孔A值)/對照孔A值。

1.3 熒光檢測［2］于6孔細胞培養板制備 BEL-7402單層細胞(1×106)，分別用100 MOI的 Ad-HT、Ad-HN、Ad-GT和Ad-EGFP進行感染，繼續培養48小時后收集細胞并重懸于磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)中，分別用 AO/EB 和DAPI進行染色，并于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 流式細胞檢測［8］按1.3所述制備病毒感染細胞，培養48小時后收集細胞并重懸于PBS中，分別用 Annexin V-FITC/PI、Rho 123和DCFA進行染色，作用30分鐘后用PBS洗滌3次，沉淀經200μl PBS重懸后用流式細胞儀分析。

1.5 Caspase酶檢測 按1.3所述制備病毒感染細胞，培養48小時后收集細胞并提取總蛋白，利用BCA檢測試劑盒進行蛋白定量后，按Caspase檢測試劑盒說明書進行Caspase酶活性檢測。

1.6 動物實驗［8］用Hanks液洗滌并稀釋H22細胞至1×107個/ml，于小鼠右后肢皮下注射0.1 ml，待腫瘤結節生長至直徑為5 mm視為模型建立。將荷瘤小鼠隨機分為5組(5只/組):第1組為生理鹽水對照組，瘤內注射生理鹽水(100μl/只)，每周2次，為期3周;第2組至第5組分別為 Ad-HT、Ad-HN、Ad-GT和Ad-EGFP治療組，瘤內注射相應病毒(109PFU/100μl/只)，每周2次，為期3周。同時設正常小鼠對照組，不接受任何處置(未荷瘤，5只)。實驗期間每日觀察模型動物存活情況，數據錄入Sigma plot軟件，繪制生存曲線，另外，實驗期間每2天用游標卡尺檢測腫瘤長、短徑長，通過公式:(短徑長2×長徑長×0.52)，計算腫瘤體積。所有實驗組模型動物于末次處置后10天處死，采集模型動物外周血并分離血清，按試劑盒說明書檢測IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量;采集模型動物脾臟并分離T淋巴細胞，按試劑盒說明書檢測細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)和天然殺傷細胞(Nature killer cells，NK)活性。

1.7 統計學方法 學生氏t檢驗用于分析組間差異，Kaplan-Meier檢驗用于分析平均生存期。

2 結果

2.1 Ad-HT對BEL-7402細胞的抑制作用 如圖1所示，Ad-HT、Ad-HN、Ad-GT和 Ad-EGFP均不同程度地表現出對BEL-7402的抑制作用，且呈現一定的劑效和時效關系趨勢，即隨感染劑量的增加和感染時間的延長，病毒對BEL-7402細胞的抑制作用隨之增強。但Ad-HN和Ad-EGFP抑瘤作用的量效關系并不明顯，時效關系也僅在高劑量組(100 MOI，48小時前)有所體現，而Ad-HT和Ad-GT的量效關系比較明顯，且在各感染劑量均呈現一定的時效關系趨勢。就抑瘤效果而言，Ad-HT優于Ad-GT、Ad-HN和 Ad-EGFP(P＜0.05)。高劑量組(100 MOI)感染48小時后，Ad-HT對BEL-7402細胞的抑制率維持在65%以上，Ad-GT的抑制率在40% ～60%間波動。而Ad-HN和Ad-EGFP的抑制率則持續下降，其中以Ad-EGFP下降最為顯著(P＜0.05)。

2.2 Ad-HT對BEL-7402細胞形態的影響 如圖2所示，經AO/EB染色，未感染細胞均呈現亮綠色，而Ad-HN、Ad-HT感染細胞則部分被染色呈現紅色或橘紅色，并伴有細胞皺縮等凋亡特征;經DAPI染色，未感染細胞的細胞核均呈現均勻一致的蘭色，而Ad-HN、Ad-HT感染細胞的細胞核則呈現亮蘭色，并伴有核內物質碎裂等凋亡特征。以上結果說明，Ad-HN、Ad-HT能夠誘導BEL-7402細胞呈現典型凋亡形態。

2.3 Ad-HT對BEL-7402細胞膜及活性氧水平的影響 如圖3所示，Annexin V檢測結果顯示，與對照組相比，Ad-HN、Ad-HT感染導致BEL-7402細胞磷脂膜外翻，說明 Ad-HN、Ad-HT感染能夠誘導BEL-7402細胞凋亡。另外，Ad-HN、Ad-HT還導致BEL-7402細胞線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potentials，△ψ)下降、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平升高。其中，Ad-HT作用略強于Ad-HN。以上結果說明，Ad-HN和Ad-HT能夠誘導BEL-7402細胞發生凋亡，且其作用與線粒體及活性氧密切相關。

圖1 MTT檢測結果Fig.1 The results of the MTT assay

圖2 Ad-HT感染對BEL-7402細胞形態的影響Fig.2 Morphological change of Ad-HT-infected BEL-7402 cells

圖3 Ad-HT對BEL-7402 Annexin V、△ψ和ROS的影響Fig.3 Effects of Ad-HT-infected on Annexin V，△ψ and ROS of BEL-7402 cells

2.4 Ad-HT感染對Caspase酶活性的影響 如圖4所示，Ad-HN、Ad-HT均不同程度上調了Caspase 1、3、6、8酶的活性，其中以 Ad-HT的作用最為明顯(P ＜0.05)。Ad-EGFP 對 Caspase 1、3、6、8 酶的活性無明顯影響，而Ad-GT的作用卻比較明顯(P＜0.05)，幾乎與Ad-HT相當，我們認為這可能與腺病毒感染導致細胞病變有關。

2.5 Ad-HT對體內實體腫瘤的抑制作用 如圖5所示，雖然實驗后期(24～30天)，Ad-HN和Ad-HT實驗組平均腫瘤體積小于其它實驗組，但實驗前期(0～24天)各實驗組平均腫瘤體積差異并不明顯，而且時常出現波動，這可能與模型動物死亡導致的平均腫瘤體積異常變化有關。然而，雖然Ad-HT減緩腫瘤生長速度的作用并不明顯，但其對模型動物平均生存期卻有明顯改善作用，實驗結束時，Ad-HT治療模型動物生存率為100%，而生理鹽水對照組、Ad-EGFP和Ad-GP治療組模型動物在17～30天內相繼死亡。

圖4 Caspase含量比較Fig.4 The content comparison of Caspase

圖5 模型動物腫瘤生長趨勢和平均生存期Fig.5 The tumor growth kinetics and the mean survival of animal model

圖6 模型動物免疫分析Fig.6 Analysis of immune of the animal model

2.6 Ad-HT對模型動物免疫的影響 如圖6所示，與正常對照組、Ad-EGFP實驗組和Ad-GT實驗組相比，在效靶比為50∶1和100∶1時，Ad-HN和 Ad-HT能夠有效增強模型動物CTL和NK活性，其中以Ad-HT作用最為明顯(P＜0.05)。另外，Ad-HN和Ad-HT實驗組IL-2和IFN-γ等Th1類細胞因子含量明顯高于其它實驗組(P＜0.05)，而IL-4和IL-10含量差異并不明顯。

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，病人早期常無明顯癥狀和體征，一旦出現典型的臨床表現時已屬于中晚期肝癌。其惡性度高、病情進展快、治療難度大、療效差、預后不好已成為其顯著特點。為提高治療的有效率、延長患者的生存期、降低患者的痛苦，人們一直在探索新的治療方向，近年來，針對細胞受體、關鍵基因和調控分子為靶點的相關研究及試驗性治療漸漸走入人們的視線。Apoptin、Suvivin、端粒酶、NDV HN、腺病毒載體等已成為常見的研究對象。雖然其中一些基因與腫瘤間的作用機制還不完全清楚，但是通過多個靶點基因作用靶向性治療腫瘤的研究已有報道［1，2，9］。針對腫瘤細胞開展多基因聯合治療，有效的、特異的抑制或殺傷腫瘤細胞已成為腫瘤基因治療的一個重要發展趨勢。

Fiola等［10］闡明了NDV在腫瘤細胞中選擇性復制的機制。NDV的抗腫瘤作用現已被廣泛認可，HN蛋白是NDV的主要結構蛋白，以N末端疏水區與病毒外膜相連，不僅能夠介導受體識別，還具有水解這些受體中唾液酸成分的神經氨酸酶活性。以前的研究表明，HN蛋白在抗腫瘤免疫反應中發揮佐劑功能，具有活化DC、巨噬細胞、NK細胞，穩定活化的T細胞，刺激細胞產生IL-12受體的β鏈等作用［1-4］。HN所誘導產生的IFN-α還可以上調一些與抗原識別、細胞間作用、細胞粘附及細胞毒作用相關的重要分子［1，11，12］。

目前，腺病毒作為一種候選載體在動物實驗和研究中已表現出良好的效果，腺病毒載體具有滴度高、感染范圍廣、DNA不整合到宿主染色體、可插入7～8 kb的外源DNA片段等優點，目前已成為基因治療、基因功能研究、反義治療、疫苗開發等領域最為常用的載體之一［13］。但重組腺病毒污染野生型病毒的問題一直沒有得到很好的解決。本研究選用的重組腺病毒是采用RAPAdⅠ重組腺病毒系統構建的［14］，該系統的基因組骨架質粒缺失了腺病毒復制和包裝相關信號序列，并將上述序列置于穿梭質粒中，使得只有腺病毒基因組骨架質粒與穿梭質粒重組后，腺病毒才能夠包裝并增殖［13］。因此，應用RAPAdⅠ系統所構建的重組腺病毒Ad-HT理論上全部經過同源重組，這大大降低了野生型腺病毒污染的機會［13］。

本研究利用本課題組構建的重組腺病毒Ad-HT以及相關對照病毒 Ad-HN、Ad-EGFP和 Ad-GT，結合分子生物學檢測方法，分析了Ad-HT對人肝癌細胞BEL-7402的抑制作用。結果顯示，除Ad-EGFP外，Ad-HN、Ad-GP與 Ad-HT同樣具有抑制 BEL-7402腫瘤細胞的作用，但Ad-HT的抑瘤效果明顯強于其它對照病毒;Ad-HT在高感染劑量(100 MOI)的前提下呈現明顯的時效關系趨勢，而在低感染劑量(1 MOI和10 MOI)時，時效關系趨勢不顯著;另外，Ad-HT能夠通過誘導細胞凋亡抑制BEL-7402腫瘤細胞增殖，而這種抑制作用可能通過影響BEL-7402細胞線粒體功能，促進其釋放活性氧物質，進而激活凋亡相關Caspase酶實現。雖然Ad-HT對模型動物體內實體腫瘤體積的抑制作用并不十分顯著，但卻能有效延長其平均生存期，這可能與Ad-HT的免疫調節功能有關。

綜上，重組腺病毒Ad-HT能夠通過誘導人肝癌細胞BEL-7402凋亡抑制其生長。另外，Ad-HT對BEL-7402的凋亡誘導作用可能通過線粒體途徑實現。同時，模型動物實驗進一步證實了表達NDV HN基因抗腫瘤雙特異性重組腺病毒Ad-HT對腫瘤細胞在免疫調節和免疫重建方面的顯著作用。總之，隨著對Ad-HT體內、外抑癌作用的不斷深入研究，其將會顯示出廣泛的應用前景。

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