腦膠質瘤組織中內皮抑素的表達及其與血管形成的關系①

陳 巖 倪朝輝 趙 剛 (吉林大學第二醫院神經外科，長春130041)

惡性膠質瘤是高度血管化的腫瘤，內皮細胞增殖所致新生血管的形成與膠質瘤的惡性程度、生物侵襲性及臨床復發進程密切相關［1］。腫瘤新生血管形成是血管生成刺激因子與抑制因子共同調節、相互制衡的結果。已有較多研究報道證實:以VEGF為代表的多種血管生成刺激因子在惡性膠質瘤組織中表達明顯升高。而對于負性調控因子，尤其是目前已知作用最強的內源性血管生成抑制因子——內皮抑素(Endostain，ES)在膠質瘤腫瘤組織中的表達情況研究尚不多見，且已有研究結果也不盡一致［2，3］。因此，本研究應用免疫組化方法檢測不同級別的人腦膠質瘤組織中內皮抑素的表達及腫瘤微血管密度(MVD)，旨在進一步明確內皮抑素蛋白水平與膠質瘤新生血管形成的關系，為應用抗血管生成療法治療腦膠質瘤提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取手術切除并經病理證實的46例腦膠質瘤患者。男31例，女15例，年齡15～64歲，平均41.6歲。其中Ⅰ級7例;Ⅱ級18例;Ⅲ級13例;Ⅳ級8例。同時取5例外傷后內減壓術的非腫瘤患者腦組織標本作為正常對照組，標本經10%福爾馬林液固定，常規石蠟包埋，5μm厚組織切片。

1.2 腦膠質瘤組織內皮抑素及MVD表達檢測內皮抑素單克隆抗體購自R＆D systems;免疫組化試劑盒購自福州邁新試劑公司。內皮抑素主要表達于血管內皮細胞及腫瘤細胞胞漿內，以胞漿中出現棕黃色顆粒為染色陽性。每張切片隨機觀察1個高倍鏡視野，計數500個細胞中陽性細胞的百分率:其中陽性細胞百分率＜5%記為(-)，5% ～20%記為(+)，21% ～50%記為(++)，百分率 ＞50%記為(+++);MVD檢測采用SP法進行CD34染色，在低倍鏡下尋找微血管最密集區，然后在400倍視野范圍內計算5個視野下的微血管數，取其平均數作為該病例的MVD值。

1.3 統計學方法 采用SPSS14.0軟件包進行統計學處理。計量數據以±s表示;計數資料數據以百分率表示，率的差異性比較采用卡方檢驗率;等級資料率的差異性比較采用Wilcoxon秩和檢驗;以P＜0.05為差異有顯著性統計學意義。

2 結果

2.1 內皮抑素在膠質瘤組織中的表達情況 5例正常腦組織及46例各級別膠質瘤組織中內皮抑素表達陽性率見表1。腦膠質瘤組織標本中，以內皮細胞中內皮抑素表達最為顯著(圖1A)。此外，在腫瘤細胞漿亦偶見內皮抑素陽性表達，尤見于新生血管內皮細胞周邊的腫瘤細胞(圖1B)。與正常腦組織相比，膠質瘤組織中內皮抑素表達百分率顯著增加(χ2=8.673，P=0.003 ＜0.01)。對內皮抑素表達程度與膠質瘤病理級別的關系行Spearman等級相關分析，顯示內皮抑素在膠質瘤血管內皮細胞中的表達強度隨腫瘤惡性程度增高而增強。

2.2 腫瘤微血管密度(MVD)檢測 不同級別的膠質瘤組織中MVD值見表2，各組間總體存在非常顯著性差異(χ2=33.204，P=0.00 ＜0.01)，進一步進行兩兩比較，除Ⅲ級與Ⅳ級之間的差異沒有統計學意義外(χ2=3.824，P=0.051 ＞0.05)，其余各級之間均存在非常顯著性差異(P值均小于0.003 3)。各級別膠質瘤組織中MVD染色見圖2。

表1 膠質瘤組織中內皮抑素表達與腫瘤病理級別關系Tab.1 Relationship between Endostatin expression with tumor pathology grade in glioma tissues

圖1 膠質瘤組織中內皮抑素表達免疫組化檢測(×400)Fig.1 Immunohistochemical detection of endostatin in gliomas tissues(×400)

2.3 內皮抑素表達強度與腫瘤MVD的關系 對表達不同強度內皮抑素的膠質瘤組織中的MVD情況進行分析發現:隨著內皮抑素蛋白表達強度的增加，MVD值呈上升趨勢(詳見表3)。

表2 膠質瘤組織MVD與病理級別的關系Tab.2 Relationship between MVD with tumor pathology grade in glioma tissues

圖2 膠質瘤組織CD34免疫組化檢測(×100)Fig.2 Immunohistochemical detection of CD34 in each grade glioma tissues(×100)

表3 膠質瘤組織中內皮抑素表達與MVD的關系Tab.3 Relationship between Endostatin expression with MVD in glioma tissues

3 討論

內皮抑素是目前已知功能最強的血管生成抑制因子，能特異性地抑制血管內皮細胞增殖，從而有效地抑制血管生成和腫瘤生長［4］。目前的研究認為內皮抑素并不是由腫瘤細胞直接產生的，而是由于機體受到腫瘤細胞通過多種途徑的刺激，激發血管生成，之后內皮細胞產生蛋白水解酶，水解膠原ⅩⅧ的C末端中心蛋白酶敏感區，水解后釋放出大小不等的生物活性片段，即為內皮抑素，并且通過血液循環到達腫瘤部位，抑制原發和繼發腫瘤血管的生成。

腦膠質瘤是富含血管的腫瘤，惡性膠質瘤如多形性膠質母細胞瘤更以高度血管化和血管內皮細胞增生為主要特征。膠質瘤細胞的不斷生長、繁殖、浸潤，必須通過膠質瘤間質血管獲得營養物質，間質血管在維持腦膠質瘤細胞生物學行為方面起著至關重要的作用。Morimoto等［2］利用內皮抑素的單克隆抗體通過免疫印跡和免疫組織化學的方法對51例星形細胞瘤內皮抑素的表達情況進行研究，發現Ⅳ級的星形細胞瘤組織中的內皮抑素表達水平明顯高于低級別的瘤組織;內皮抑素的免疫染色定位于所有級別的腫瘤血管上，在惡性腦膠質瘤中內皮抑素的陽性染色甚至廣泛包繞著靠近增生微血管周的瘤細胞。本研究結果與其基本一致，且研究還發現，隨著膠質瘤病理級別的增高，其MVD值增加，并且組織中內皮抑素的表達量也呈現增高趨勢。但是這一結果似乎與膠質瘤高度血管化的臨床病理特征相矛盾。考慮原因可能為隨著腫瘤惡性程度的增高，其血管內皮細胞高度增生，使得腫瘤組織中血管內皮生成因子表達升高，從而促進腫瘤組織中多種膠原酶表達上調，而內皮抑素是ⅩⅧ型膠原C端的一個水解片段，膠原酶表達增多可以促進內皮抑素的生成增多。而Ratel等［5］認為惡性腫瘤組織以及血清中內皮抑素抗體的存在可能使得腫瘤可以逃逸血管生成分子的作用，使得血管生成促進因子和抑制因子之間的平衡仍偏向血管生成有關。國內學者［6］也認為其原因可能為機體內部存在著某種平衡的機制，當腫瘤組織中血管內皮生成因子水平升高時，內皮抑素的表達水平也隨之升高以期達到一種新的平衡狀態。但是由于兩者之間的表達上調速度不一致，血管內皮生成因子水平上調快而內皮抑素水平上調慢，導致在腫瘤組織中主要表現為促進新生血管生成，從而使得腫瘤快速生長。腫瘤組織中血管生成調控的復雜性可能也是某些腫瘤組織中內皮抑素低表達的原因所在。總之，腫瘤組織中新生血管形成的調控機制以及與之相關的內皮抑素蛋白的加工及滅活機制均有待進一步研究，抗血管生成療法也將有望成為徹底治愈腦膠質瘤的有效手段之一。

1 Wong M L，Prawira A，Kaye A H et al.Tumour angiogenesis:its mechanism and therapeutic implications in malignant gliomas［J］.J Clin Neurosci，2009;16(9):1119-1130.

2 Morimoto T，Aoyagi M，Tamaki M et al.Increased levels of tissue endostatin in human malignant gliomas［J］.Clin Cancer Res，2002;8(9):2933-2988.

3 Strik H M，Schluesener H J，Seid K et al.Localization of endostatin in ratand human gliomas［J］.Cancer，2001;91(5):1013-1019.

4 Fujita Y，Abe R，Shimizu H.Clinical approaches toward tumor angiogenesis:past，present and future［J］.Curr Pharm，2008;14(36):3820-3834.

5 Ratel D，Nasser V，Dupre L et al.Antibodies to endostatin in a multifocal glioblastoma patient［J］.Lancet，2000;356(9242):1656-1657.

6 高文宏，陳謙學，劉 剛.內皮抑素和血管內皮生長因子在腦膠質瘤中的表達及意義［J］.中國臨床神經外科雜志，2006;11(2):86-87.