不同體外刺激對小鼠腹腔產生IL-10的B細胞的影響①

張繼剛 任 婧 萬 明 高繼鑫 李 巍 劉玉峰

(第四軍醫大學西京醫院全軍皮膚病研究所，西安710032)

B細胞是機體適應性免疫應答的重要組成部分，根據其功能和在體內存在部位的不同可分為B1細胞和B2細胞兩個亞群，脾臟中大多為B2細胞，而腹膜腔中大多為 B1細胞［1］。2008 年，Yanaba等［2］在正常小鼠脾臟中鑒定出一個具有負向免疫調節功能的B細胞亞群，其表型為CDldhiCD5+CD19hi，由于其免疫調節功能依賴于IL-10，又稱之為B10細胞。小鼠腹腔中也存在能夠通過產生IL-10而發揮負向免疫調節功能的B細胞，由于未發現其具有特異性的表型標志，這群細胞被稱之為腹腔產生IL-10的B細胞［3］，但也有研究者認為在一定刺激下產生IL-10是B10細胞最好的標志［4］，因此腹腔產生IL-10的B細胞也可稱之為腹腔B10細胞。目前關于腹腔產生IL-10的B細胞與B1細胞之間的關系尚不清楚，關于其的活化和成熟的信號特點也知之甚少，本研究對小鼠腹腔細胞進行體外培養，給予不同的刺激，分析促進小鼠腹腔產生IL-10的B細胞的活化和成熟的信號特點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級 BALB/c小鼠，雌雄各半，8～12周，購于第四軍醫大學實驗動物中心。

1.1.2 試劑與儀器 PE-anti-IL-10，PE/Cy5-anti-CD19，anti-CD16/CD32，莫能星(monensin)，PE-Rat IgG2b isotype control均購自eBioscience公司;anti-CD40、固定劑、破膜劑購自Biolegend公司;anti-IgM F(ab')2購自Jackson ImmunoResearch Laboratories;脂多糖(LPS)、離子霉素(Ionomycin)、佛波酯(PMA)購自Sigma公司;RPMI1640培養基購自Gibco公司;流式細胞儀為Beckman Coulter公司產品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔細胞分離 小鼠斷頸處死，75%酒精浸泡消毒后仰面置于解剖板上，在下腹部剪開分離皮膚，暴露腹膜，腹白線處剪一小口，用槍頭打入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗腹腔，輕輕揉捏腹部，彎頭滴管吸出灌洗液，置于10 ml離心管，離心管插于冰盒中，重復3次。1 000 r/min離心5分鐘，棄上清，加入1 ml RPMI1640細胞培養液重懸，細胞計數。

1.2.2 細胞培養 取2×106細胞于24孔板，RPMI 1640培養基加至1 ml，分別培養5小時和48小時，培養5小時者每孔加入佛波酯(PMA，50 ng/ml)+離子霉素(Ionomycin，500 ng/ml)作為基礎刺激，莫能星(Monensin，2μmol/L)作為阻止IL-10向細胞外分泌的阻斷劑(即PIM 5小時)，再分別加入LPS(10 μg/ml)、soluble anti-IgM F(ab')2(10 μg/ml)、coated anti-IgM F(ab')2(10 μg/ml)、anti-CD40(1 μg/ml)刺激5小時。培養48小時者分別用LPS、soluble anti-IgM F(ab')2(10 μg/ml)、coated anti-IgM F(ab')2(10 μg/ml)、anti-CD40(1μg/ml)刺激48小時，最后5小時加入PIM。

其中coated anti-IgM F(ab')2為預包被anti-IgM F(ab')2刺激，用pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋anti-IgM F(ab')2，濃度為10μg/ml。加入24孔板，每孔300μl，4℃過夜后取出24孔板，小心吸去包被液，無菌PBS洗5遍，備用。

1.2.3 流式細胞儀檢測 取1×106刺激后細胞于流式管，流式洗滌液1 500 ml洗滌2次(1 000 r/min離心，5分鐘)，加入封閉抗體anti-CD16/CD32 4℃15分鐘，流式洗滌液1 500 ml洗滌2次(1 000 r/min離心，5分鐘)。細胞懸液100μl加入PE/Cy5-anti-CD19 1μl，4℃下避光反應30分鐘，洗滌2次(1 000 r/min離心，5分鐘)。將待測細胞加入固定劑，室溫避光20分鐘，400 r/min離心6分鐘。500 ml破膜劑洗滌3次(400 r/min離心，6分鐘)，細胞懸液100μl加入PE-anti-IL-10 1μl，室溫避光反應20分鐘，500 ml破膜劑洗滌2次(400 r/min離心，6分鐘)，300 ml流式洗滌液重懸，流式細胞儀分析。

1.3 統計學分析 用統計軟件SPSS10.0分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同體外刺激5小時對小鼠腹腔產生IL-10的B細胞的影響 在不加任何刺激的情況下，小鼠腹腔IL-10+B細胞平均只占CD19+B細胞的1.53%，加入PIM后IL-10+B細胞比例明顯升高，達14.69%(P＜0.01)，在 PIM 刺激的基礎上加入soluble anti-IgM F(ab')2或anti-CD40均不能明顯提高小鼠腹腔B細胞IL-10的表達(P＞0.05)，而加入LPS后，IL-10的表達水平升高至平均26.53%，明顯高于PIM、soluble anti-IgM F(ab')2+PIM和anti-CD40+PIM 刺激組(P ＜0.01，圖1)。

圖1 不同體外刺激5小時對小鼠腹腔產生IL-10的B細胞的影響Fig.1 The effect of different stimulation in vitro for 5 h on IL-10-producing B cells in peritoneal cavity of mice

圖2 不同體外刺激48小時對小鼠腹腔產生IL-10的B細胞的影響Fig.2 The effect of different stimulation in vitro for 48 h on IL-10-producing B cells in peritoneal cavity of mice

圖3 不同強度anti-IgM刺激對小鼠腹腔產生IL-10的B細胞的影響Fig.3 The effect of anti-IgM stimulation with different strength in vitro on IL-10-producing B cells in peritoneal cavity of mice

2.2 不同體外刺激48小時對小鼠腹腔產生IL-10的B細胞的影響 在培養基中培養48小時，小鼠腹腔IL-10+B細胞平均占CD19+B細胞的1.66%，最后5小時加入PIM后IL-10+B細胞比例升高至16.24%(P ＜ 0.01)，soluble anti-IgM F(ab')2、anti-CD40和LPS刺激48小時，最后5小時加入PIM，小鼠腹腔IL-10+B細胞比例分別為20.43%、29.27%和38.16%。soluble anti-IgM F(ab')2刺激組 IL-10+B細胞比例略有升高(P＜0.05)，而anti-CD40和LPS刺激48小時均能明顯提高IL-10+B細胞比例(P ＜0.01，圖 2)。

2.3 不同強度anti-IgM刺激對小鼠腹腔產生IL-10的B細胞的影響在體外刺激5小時的情況下，soluble anti-IgM F(ab')2對小鼠腹腔B細胞產生IL-10沒有明顯影響，而coated anti-IgM可抑制PIM對腹腔B細胞產生IL-10的活化作用(P＜0.05)。體外刺激48小時時，soluble anti-IgM F(ab')2對腹腔B細胞表達IL-10有輕度促進作用，而coated anti-IgM明顯抑制腹腔B細胞產生IL-10(P＜0.01，圖3)。

3 討論

一般認為B細胞通過產生抗體、遞呈抗原、提供協同刺激信號等發揮正向免疫應答作用。1996年，Janeway及其同事［5］發現用混合完全氟氏佐劑的髓磷脂堿性蛋白(Myelin Basic Protein，MBP)免疫B細胞缺陷小鼠(μMT)所誘導的實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)比在正常小鼠誘導的EAE要嚴重得多，并且不象正常小鼠誘導的EAE那樣能自行緩解，分泌IL-10的B細胞的缺陷是造成μMT鼠EAE顯著加重的原因，由此真正開始了B細胞負向免疫調節功能的研究。1997年Bhan等［6］對B細胞在自身免疫性結腸炎中的調節作用進行了分析，他們將μMT小鼠與能夠自發產生結腸炎的T細胞受體α鏈基因敲除小鼠(TCRα-/-)交配，子代小鼠自發產生的腸道炎癥出現更早且更嚴重，提示B細胞及其分泌的細胞因子在抑制炎癥反應中具有重要作用，據此Bhan首次提出了“調節性B細胞”的概念。之后又在多種自身免疫性疾病的小鼠模型中驗證了調節性B細胞的存在和功能，如Ⅰ型糖尿病、膠原誘導關節炎、系統性紅斑狼瘡、接觸性超敏反應等［7-11］。

小鼠脾臟B10細胞的鑒定是調節性B細胞研究領域的一個重要進展，為進一步研究其發育和功能特點奠定了基礎［2］。同時研究者發現小鼠腹腔中也存在大量產生IL-10的B細胞，但關于這一群B細胞的表型特點及其與腹腔B1細胞的關系尚不明確，甚至是否這一群細胞也可稱之為B10細胞也還存在爭議，目前暫稱之為腹腔產生IL-10的B細胞，關于這一群細胞活化、成熟的信號特點還知之甚少。

一般認為在5小時刺激時間，誘導B細胞表達IL-10是通過細胞活化實現的［12］，我們用 anti-IgM刺激模擬BCR信號，coated anti-IgM可更有效地誘導BCR交聯，可產生比soluble anti-IgM刺激更強的BCR信號，soluble anti-IgM和anti-CD40刺激對腹腔產生IL-10的B細胞的活化無明顯作用，coated anti-IgM刺激反而抑制腹腔產生IL-10的B細胞的活化。LPS+PIM是誘導腹腔B細胞表達IL-10的最佳刺激，表明固有免疫應答的信號可能參與了腹腔產生IL-10的B細胞的活化過程。

在體外刺激48小時時，促進IL-10+B細胞比例升高主要是通過誘導其前體細胞成熟實現的［12，13］，延長刺激時間至 48 小時，LPS 和 anti-CD40刺激可大幅度增加小鼠腹腔IL-10+B細胞比例，soluble anti-IgM刺激可使腹腔B細胞IL-10的表達略有增加。而可產生更強BCR信號的coated anti-IgM可明顯抑制小鼠腹腔產生IL-10的B細胞的前體細胞的成熟。可見，BCR信號在腹腔產生IL-10的B細胞的活化和成熟過程中具有復雜的作用，具體發揮怎樣的作用依賴于作用時間和信號強度，其機制和意義尚有待于進一步的研究。

關于腹腔產生IL-10的B細胞與腹腔B1細胞、脾臟B10細胞等之間的譜系關系尚無明確認識，關于其發育、成熟、擴增、活化的信號特點也知之甚少，發現腹腔產生IL-10的B細胞的活化、成熟的信號特點，將為明確這些問題奠定基礎。

1 LeBien T W，Thomas F T.B-lymphocytes:how they develop and function［J］.Blood，2008;112(5):1570-1579.

2 Yanaba K，Bouaziz J D，Haas K M et al.A regulatory B cell subset with a unique CD1dhiCD5+phenotype controls T cell-dependent inflammatory responses［J］.Immunity，2008;28(5):639-650.

3 Jean-David Bouaziz，Koichi Yanaba，Thomas F T.Regulatory B cells as inhibitors of immune responses and inflammation［J］.Immunol Rev，2008;224:201-214.

4 Paul A B，Lina Yassin Norena，Fabian Flores-Borja et al.CD19+CD24highCD38highB cells exhibit regulatory capacity in healthy individuals but are functionally impaired in systemic lupus erythematosus patients［J］.Immunity，2010;32(1):129-140.

5 Wolf S D，Fridrika B D，Hardardottir F et al.Experimental autoimmune encephalomyelitis induction in genetically B cell-deficient mice［J］.JExp Med，1996;184(6):2271-2278.

6 Mizoguchi A，Mizoguchi E，Smith N R et al.Suppressive role of B cells in chronic colitis of T cell receptor alpha mutant mice［J］.JExp Med，1997;186(10):1749-1756.

7 Hussain S，Delovitch T L.Intravenous transfusion of BCR-activated B cells protects NOD mice from type 1 diabetes in an IL-10-dependent manner［J］.J Immunol，2007;179(11):7225-7232.

8 Blair PA，Chavez-Rueda K A，Evans JG et al.Selective targeting of B cells with agonistic anti-CD40 is an efficacious strategy for the generation of induced regulatory T2-like B cells and for the suppression of lupus in MRL/lpr mice［J］.J Immunol，2009;182(6):3492-3502.

9 Evans J G，Chavez-Rueda K A，Eddaoudi A et al.Novel suppressive function of transitional 2 B cells in experimental arthritis［J］.JImmunol，2007;178(12):7868-7878.

10 Karen M Haas，Rei Watanabe，Takashi Matsushita et al.Protective and pathogenic roles for B cells during systemic autoimmunity in NZB/W F1 mice［J］.J Immunol，2010;184(9):4789-4800.

11 Watanabe R，Fujimoto M，Ishiura N et al.CD19 expression in B cells is important for suppression of contact hypersensitivity［J］.Am J Pathol，2007;171(2):560-570.

12 Yanaba K，Bouaziz J D，Matsushita T et al.The development and function of regulatory B cells expressing IL-10(B10 cells)requires antigen receptor diversity and TLR signals［J］.JImmunol，2009;182(12):7459-7472.

13 Haas K M，Watanabe R，Matsushita T et al.Protective and pathogenic roles for B cells during systemic autoimmunity in NZB/WF1 mice［J］.J Immunol，2010;184(9):4789-4800.