過敏性紫癜患兒血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與血清IgA水平關(guān)系探討①

袁麗萍 張 琴 鹿 玲 (安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，合肥230022)

過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)是兒童時期、一種較常見的毛細(xì)血管變態(tài)反應(yīng)性出血性疾病，可伴有消化道癥狀、關(guān)節(jié)腫痛及腎臟損害。其病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前認(rèn)為HSP是一種由IgA介導(dǎo)的循環(huán)免疫復(fù)合物介導(dǎo)的系統(tǒng)性血管炎，即體內(nèi)IgA-IC免疫復(fù)合物形成并沉積于局部血管，激活補(bǔ)體，引起中性粒細(xì)胞及一系列細(xì)胞因子活化，導(dǎo)致血管受損［1］。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular endothelial cells，VEC)是血液和血管平滑肌的屏障，是血管中首先受損的部分。最新研究發(fā)現(xiàn)HSP患兒PBMC培養(yǎng)上清可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［2］，但是HSP患兒本身VEC凋亡及體內(nèi)IgA水平與其VEC凋亡的關(guān)系迄今卻未見報道。因此，本研究通過ELISA法檢測HSP患兒血清中IgA水平，TUNEL法檢測其皮膚組織中VEC凋亡的情況，并分離HSP患兒血清中IgA，觀察IgA對培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞凋亡的影響，初步探討IgA與HSP患兒VEC凋亡的關(guān)系，為進(jìn)一步明確HSP發(fā)病機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2004年1月～2005年12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科住院的HSP患兒40例，男性22 例，女性18 例，年齡3.5 ～13.5 歲，平均8.5歲，均符合2005年歐洲風(fēng)濕病學(xué)會修訂的HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。HSP患兒中有消化道出血癥狀10例，有不同程度血尿、蛋白尿及其他腎臟受累癥狀14例，排除上述癥狀的其他病例16例。正常對照組為無過敏性疾病史的健康體檢兒童10例，其中男5例，女5例，年齡3～12歲。各組年齡、性別分布情況見表1，各組年齡、性別無顯著性差異(P＞0.05)。所有研究對象均于清晨空腹抽取周圍靜脈血5 ml留取用于IgA分離。采集標(biāo)本前1月內(nèi)均未接受激素及免疫抑制劑或調(diào)節(jié)劑治療。受試者家屬對實驗均已知情，并經(jīng)醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會討論通過。

1.2 實驗方法

1.2.1 外周血采集 各病例組在HSP急性期，清晨空腹采取周圍靜脈血2 ml非抗凝全血，室溫下放置2小時后，離心機(jī)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，取血清放于-80℃低溫冰箱中保存，一部分用于ELISA檢測血清中IgA水平，其余用于IgA的分離。健康對照組血液標(biāo)本采集方法同上。

1.2.2 皮膚標(biāo)本采集 各病例組患兒用2%利多卡因進(jìn)行局部麻醉下，在下肢伸側(cè)皮損區(qū)(新鮮皮疹)邊緣皮膚用角膜環(huán)鉆取直徑為6～8 mm大小的皮膚組織。健康對照組10例標(biāo)本取自整形科患兒正常皮膚組織。

1.2.3 TUNEL凋亡細(xì)胞顯示方法 (采用AP原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒)石蠟切片脫蠟入水后，以新鮮配制的3%H2O2室溫10分鐘滅活內(nèi)源性過氧化物酶。以Proteinase K，37℃消化5分鐘。滴加DIG-dUTP和標(biāo)記緩沖液，4℃標(biāo)記過夜。封閉液室溫30分鐘，滴加堿性磷酸酶-抗地高辛抗體，37℃ 30分鐘。滴加新鮮配制的BCIP/NBT顯色液，鏡下控制顯色時間，水洗終止顯色，油鏡下觀察結(jié)果。凋亡細(xì)胞為胞核著色，染色呈棕黃色。凋亡指數(shù)(AI)為每100個血管內(nèi)皮細(xì)胞中染色陽性的凋亡細(xì)胞。

1.2.4 IgA的分離與鑒定 取HSP患兒血清，采用Jacalin親和層析分離血清中 IgA［4］，過程如下:血清用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate bufer saline，PBS)按1∶1稀釋后上Jacalin親和層析柱(Pierce Chemical Company，USA)，于室溫孵育30分鐘，用175 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)以1 ml/min的速度洗去未與Jacalin結(jié)合的成分，用含0.1 mol/L蜜二糖的175 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)以1 ml/min的速度洗脫與Jacalin結(jié)合的成分，洗脫液蛋白經(jīng)瓊脂糖交叉免疫雙擴(kuò)散實驗和免疫電泳實驗證實為IgA，將洗脫液用分子量20 000的聚乙二醇(PEG 20 000)濃縮，放入200倍體積的蒸餾水中透析以去除蜜二糖。用Bradford法測定所得樣品中IgA的濃度。

1.2.5 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HUVEC細(xì)胞購自南京凱基生物有限公司，用含10%胎牛血清(Hyclone公司)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，放入37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天換液一次，待細(xì)胞長至融合狀態(tài)時，可傳代，取傳自Ⅲ～Ⅳ代細(xì)胞進(jìn)行實驗。

將分化成熟的HUVEC按每孔106個細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔體積2 ml。將 6孔板放入37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至部分融合后，每孔用PBS洗滌2次。隨機(jī)將細(xì)胞分為4組:①空白對照組:HUVEC于無血清培養(yǎng)液;②正常對照組:HUVEC于含有正常血清中分離的IgA 250 mg/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時;③HSP組:HUVEC于含有HSP血清中分離的IgA 250 mg/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所有計量資料均用±s表示;多組資料間比較，采用單因素方差分析(One-way ANOVA);對有相關(guān)趨勢的變量采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.01為有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 HSP患兒急性期血清IgA水平變化 各組血清中IgA濃度見表1，HSP患兒普通型、合并腎臟受累(腎型)、合并消化道出血(腹型)急性期血清IgA濃度與健康對照組相比較均明顯升高(P＜0.01);而HSP各型比較無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 TUNEL法檢測HSP患兒皮膚組織中VEC細(xì)胞凋亡 TUNEL染色方法結(jié)果顯示顯微鏡下可見皮膚中凋亡VEC細(xì)胞核呈棕黃色，健康對照組可見少量的細(xì)胞核為棕黃色的VEC，HSP組可見較多分布凋亡細(xì)胞，尤其在腎型和腹型HSP組(圖1)。對各組VEC凋亡細(xì)胞計數(shù)結(jié)果表明HSP各組凋亡指數(shù)與健康對照組比較有顯著差異(P＜0.01)，而HSP各型凋亡指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組年齡、性別分布狀況Tab.1 Ages and sex in groups

表2 HSP患兒急性期血清IgA水平(±s)Tab.2 IgA levels in serum of HSP patients during active stage±s)

表2 HSP患兒急性期血清IgA水平(±s)Tab.2 IgA levels in serum of HSP patients during active stage±s)

Note:1)P ＜0.01，compared with healthy control group.

Groups n IgA(g/L)HSP(general type) 16 2.87 ±0.581)HSP(renal type) 14 3.26 ±0.951)HSP(abdominal type) 10 3.63 ±0.861)Normal control 10 1.82 ±0.57

圖1 TUNEL法檢測HSP患兒皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(×200)Fig.1 Apoptosis of HUVEC in skin of HSP patients by TUNEL methods(×200)

圖2 HSP患兒皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平Fig.2 Apoptosis index of HUVEC in skin of HSP patients

圖3 HSP患兒血清IgA水平與皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡關(guān)系Fig.3 Correlation between the serum IgA levels and apoptosis of HUVEC in skin of HSP patients

2.3 HSP患兒急性期血清IgA水平與其血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡關(guān)系 經(jīng)Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，HSP患兒血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)與其血清中IgA水平呈正相關(guān)((r=0.23，P ＜0.01，圖 3)，提示 HSP 患兒VEC凋亡可能與IgA水平有關(guān)系。

圖4 流式法測定HSP患兒血清中IgA對HUVEC凋亡的影響Fig.4 Apoptosis rate of HUVEC induced by IgA with FCM

表3 流式法測定IgA誘導(dǎo)的HUVEC凋亡率(±s)Tab.3 Apoptosis rate of HUVEC induced by IgA with FCM(±s)

表3 流式法測定IgA誘導(dǎo)的HUVEC凋亡率(±s)Tab.3 Apoptosis rate of HUVEC induced by IgA with FCM(±s)

Note:1)P ＜0.01，compared with HSP group.

Groups n Apoptosis rate(%)1640 10 6.12 ±0.241)HSP 10 17.53 ±0.82

2.4 HSP患兒急性期血清中分離的IgA水平誘導(dǎo)HUVEC凋亡的作用 用流式細(xì)胞儀檢測HSP患兒血清中IgA對分離培養(yǎng)的HUVEC凋亡的影響，結(jié)果顯示與1640空白對照組比較，IgA顯著誘導(dǎo)分離培養(yǎng)的HUVEC 凋亡(17.53 ±0.82 vs 6.12 ±0.24)，見圖 4、表 3。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡發(fā)生在許多過程中:胚胎發(fā)生、腫瘤發(fā)生、自身免疫等。血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的血管功能異常，將引起多種炎癥性疾病的發(fā)生。文獻(xiàn)檢索結(jié)果顯示［5］，血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡在多種系統(tǒng)性血管炎疾病發(fā)生中的作用目前受到學(xué)者們越來越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)在川崎病、變應(yīng)性肉芽腫病及韋格納肉芽腫等血管炎疾病中觀察到內(nèi)皮細(xì)胞凋亡上調(diào)，加重血管壁的炎癥反應(yīng)［6］。這些結(jié)果提示血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在血管炎發(fā)病機(jī)制中可能起著比我們所想象的更重要的作用，這可能為血管炎治療提供新的干預(yù)措施。

本研究中我們采用皮膚環(huán)鉆行皮膚組織活檢，TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)在HSP患兒皮膚中可以看到明顯的VEC凋亡，且其血清中IgA水平明顯升高，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HSP患兒VEC凋亡與血清中IgA水平有著顯著相關(guān)性，提示HSP患兒VEC凋亡可能與IgA高表達(dá)有關(guān)。為深入探討HSP患兒血清中IgA與VEC凋亡的關(guān)系，我們分離了HSP患兒血清中IgA，觀察其對分離培養(yǎng)的HUVEC凋亡的影響，結(jié)果顯示IgA誘導(dǎo)下，HUVEC發(fā)生顯著凋亡。

研究證實血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是HSP發(fā)生的病理基礎(chǔ)［7］。血管內(nèi)皮細(xì)胞在各種致炎因素(如內(nèi)毒素、病毒、抗原/抗體復(fù)合物、血流動力學(xué)的改變、血小板、激素和一氧化碳等)的攻擊下，血管內(nèi)皮細(xì)胞常常發(fā)生損傷或凋亡。凋亡的VEC導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，最后導(dǎo)致微血管通透性升高。我們研究初步證實HSP患兒血清中IgA與其血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)，這也許是HSP患兒血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的一可能機(jī)制，但是IgA誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制及與HSP患兒血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)系有待深入研究。

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