Wip1對腫瘤發生及免疫系統的調節作用①

史建峰 胡雪蓮 劉光偉 趙 勇

(中國科學院動物研究所生物膜與膜生物工程國家重點實驗室移植生物學研究組，北京100101)

1 Wip1基因和蛋白結構

Wip1(Wild type p53-induced phosphatase 1)是于1997年由Fiscella等在尋找γ射線照射下p53基因的靶基因時發現，為一種依賴于p53高表達的原癌基因。Wip1屬于絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，主要定位于胞核內，由PPM1D(Protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta)基因編碼。PPM1D位于人染色體17q23/q24區域，在小鼠中位于11號染色體與p53基因鄰近，共有6個編碼區。小鼠與人PPM1D基因有83%的同源性。人Wip1有605個氨基酸，分子量61 kD，小鼠Wip1包括598個氨基酸，分子量為66 kD。人Wip1序列可分為兩個主要區域，N端第1～375位氨基酸為高度保守的磷酸酶區，第376～605位氨基酸為低保守無催化區，第65～368位氨基酸與PP2C蛋白酶家族有高度同源性，其中N端有3個區域完全相同，第100～108位氨基酸是PP2C蛋白酶家族的標簽，且Wip1激活依賴于二價陽離子和對岡田酸的不敏感，使之區別于PP1(Protein phosphatase type 1)、PP2A(Protein phosphatase type 2A)和PP2B(Protein phosphatase type 2B)家族磷酸蛋白酶，因此將Wip1歸屬于PP2C(Protein phosphatase type 2C)蛋 白酶 家族［1，2］。PPM1D 的mRNA在成年鼠和胚胎鼠的各種器官中均有表達，在雄鼠睪丸中表達水平最高［3］。

2 Wip1與DNA修復和腫瘤發生

對Wip1的研究主要集中于其對DNA修復及腫瘤發生的調控。2000年，小鼠PPM1D基因被克隆并測序，證實其在p53誘導細胞凋亡通路中發揮極其重要的負調節作用。它使p53蛋白去磷酸化而失活，導致其誘導細胞凋亡的通路中斷，從而實現其抗凋亡功能［2］。Wip1對p53的調控作用具有多樣性而且參與許多重要生命活動調節。外界環境壓力(如離子輻射、紫外光、化學試劑等)引起DNA損傷，機體存在一套精密的調節機制使DNA自我修復或者促進病變細胞發生凋亡。研究表明，Wip1蛋白可以對機體的DNA損傷修復產生負調控作用，Wip1蛋白表達依賴于p53蛋白［1，4］。Wip1可以通過負調控 p38、p53、ATM(Ataxia-telangiectasia mutated)、Chk1/Chk2等激酶來影響真核細胞DNA損傷修復功能:p38基因是第一個被確定的PPM1D靶基因，在紫外線或γ射線照射下，p38蛋白Thr180和Tyr182位點迅速發生磷酸化，p38蛋白激活后進一步磷酸化其下游 p53 蛋白 Ser15、Ser33、Ser46和 Ser392位點，從而激活p53蛋白導致細胞周期阻滯或細胞凋亡［5，6］。而Wip1是p38-MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase)/p53途徑中的負反饋調節因子，Wip1蛋白既可以通過去磷酸化p38蛋白(Thr180)蛋白激酶抑制p38通路下游分子p53蛋白的活性，也可以通過直接使p53蛋白(Ser15)去磷酸化而抑制其活性并終止其信號通路(圖 1)［4］。

ATM具有調控DNA修復和細胞周期關卡、維持染色體穩定等生物功能。DNA損傷導致PIKK(Phosphatidylinositol 3-kinase-like protein kinases)激酶誘導ATM/ATR(Ataxia-telangiectasia and Rad3-related)等活化，ATR激酶使Chk1蛋白Ser317和Ser345位點發生磷酸化而被激活。ATM磷酸化引起Chk2的Ser516和Thr387發生自身磷酸化，使Chk2獲得激酶活性。Chk1和Chk2使下游p53蛋白和Cdc25(Cell division cyclin 25)家族成員和其他底物發生磷酸化，將損傷信號傳遞至下游，引發細胞周期阻滯及DNA損傷修復等生物學效應［7-10］，ATM還可以磷酸化MDM2(Murine double minute-2)Ser395位點，MDM2 是E3泛素連接酶，作為p53蛋白的抑制子MDM2與p53蛋白結合，促進p53蛋白泛素化修飾和降解及其出核移位過程，從而抑制p53蛋白的轉錄活性。同時p53蛋白也控制MDM2蛋白表達水平以保證細胞正常生命周期［11］。DNA損傷因素誘導p53蛋白/MDM2磷酸化修飾，ATM磷酸化MDM2的Ser395位點，其酸性保守區域Ⅱ(氨基酸237～260)高度磷酸化，從而抑制p53/MDM2復合體的形成，減弱MDM2對p53的降解作用［12，13］。Wip1 可以負調節 ATM(Ser1981)、MDM2(Ser395)、Chk2(Thr68)的磷酸化從而抑制ATM和p53功能(圖1)。研究表明Wip1缺失導致ATM激酶的激活，過表達則明顯減少ATM的激活［14］。

Wip1負調控DNA損傷修復從而抑制細胞凋亡，使機體易于發生腫瘤，因此，Wip1表現出原癌基因特性。但是Wip1的致癌機制目前還未完全闡述清楚。Wip1在人乳腺癌、惡性腦瘤、卵巢癌中高表達［1，6，15-18］。研究表明，腫瘤發生時常會伴隨 p53 蛋白編碼基因TP53的突變，而Wip1過表達的乳腺癌病例中卻很少發現 TP53 基因發生突變［6，19，20］，有人推測Wip1并不是誘發TP53基因突變引起腫瘤，而是通過抑制p53蛋白的功能促進腫瘤發生。Wip1不僅可以通過調節ATM、MDM2、Chk1、Chk2和 p38MAPK間接負調控p53蛋白，還可以直接作用于p53使其N端(Ser15)去磷酸化導致失活［5］。但是，這些通路在腫瘤發生中的作用需要更多的癌癥模型佐證。

3 Wip1對免疫系統的調控作用

圖1 Wip1調控p53的信號途徑簡圖Fig.1 The Wip1-p53 regulating pathway

Wip1基因的表達受一些非p53依賴的因子調控，如CREB(cAMP-response element binding protein)和 NF-κB［21-23］。NF-κB 在細胞炎癥反應中發揮重要作用，它可以激活WIP1基因的表達。Wip1基因有一段保守的κB結合位點，并且上調和抑制NF-κB的功能分別導致Wip1表達升高和降低。研究證實，NF-κB的p65亞基可以直接結合到Wip1基因上游啟動子從而調控其生物學活性［22］;反之 Wip1對NF-κB具有負調控作用，通過基因組水平的siRNA篩選發現抑制Wip1可以使NF-κB的活化能力增強。Wip1-/-小鼠 Hela細胞中 NF-κB目標基因如TNF-α的mRNA表達升高，Wip1-/-小鼠脾細胞分泌NF-κB 依賴的炎癥因子上調，CD80+、MHCⅡ+和CD40+脾細胞比率也有相應的升高，而Wip1過表達的小鼠Hela細胞中TNF-α等NF-κB依賴的細胞因子分泌量明顯降低［3］。研究表明，Wip1對NF-κB的調控發生在其與DNA結合的上游。Wip1通過使NF-κB的P65(Ser536)去磷酸化使 NF-κB不能招募共轉錄因子p300，導致其不能有效激活下游通路。Wip1也可以通過負調節p38來抑制NF-κB功能，使NF-κB 依賴的炎癥因子如 IL-1、6、8 表達量降低［24］。此外，研究發現，Wip1-/-小鼠脾臟、淋巴結和骨髓都會發生不同程度的腫大并伴隨巨噬細胞和粒細胞增多，5%Wip1-/-小鼠發生皮膚潰瘍，Wip1-/-的小鼠在外界抗原刺激表現出免疫缺陷更容易受到感染。以上結果提示，Wip1具有抑制炎癥反應的作用［3，24］。Wip1對NF-κB具有負調作用，腫瘤發生會促進炎癥反應，NF-κB作為一個炎癥反應的重要調節因子，在調控腫瘤發生中也發揮了作用，但目前NF-κB對腫瘤發生的正負調控還存在爭議，所以Wip1是否可以通過調節NF-κB的功能間接調控腫瘤發生還有待更深層的研究。

Wip1對淋巴免疫細胞發育和功能具有調節功能，Wip1-/-幼年小鼠胸腺變小，胸腺髓質區相對于正常小鼠顯著變小，TCR-β+的胸腺細胞數量顯著降低，TCR-γδ+細胞數卻不受影響。Wip1-/-小鼠SP期(CD4+或CD8+)和DP期(CD4+CD8+)細胞比率正常，但是細胞數目下降。DN期(CD4-CD8-)細胞數目正常，但是細胞比率增加。說明Wip1-/-小鼠胸腺細胞從DN期到SP期發育過程中存在缺陷。進一步研究發現，Wip1-/-小鼠DN3(CD44-CD25+)期細胞比率升高而DN4(CD44-CD25-)期比率和數量都發生下降，這是因為Wip1 mRNA在DN3期向DN4期發育過程中表達升高，Wip1-/-小鼠胸腺細胞失去對p53蛋白活性負調功能，導致胸腺細胞由DN3期向DN4期發育時p53蛋白表達上調至使細胞周期阻滯，使更多的細胞處于S/G2/M期，從而引起Wip1-/-小鼠DN4期、DP期和SP期細胞數目減少［25］。

Wip1-/-小鼠外周免疫器官也有組織病理學表征，如脾臟白髓縮小、白髓與紅髓界限不清，并伴隨其他細胞浸潤。Wip1-/-小鼠脾臟T、B細胞數目相對于正常鼠沒有改變，但是CD4+細胞數增加，CD8+細胞數減少。T細胞和B細胞在外界抗原和絲裂原刺激后，表現出的增殖能力相比正常小鼠顯著下降［26］。Wip1可以影響淋巴細胞的發育分化及其功能，Wip1在免疫監視和機體穩態平衡調解中可能發揮功能，對免疫細胞殺傷癌變細胞保持機體穩態具有一定的調節作用。

4 結束語

雖然Wip1早在1997年就已發現，其在腫瘤發生、免疫系統發育等方面發揮重要調節作用。但目前我們對Wip1的研究仍不夠全面。在腫瘤和免疫疾病模型中Wip1調控分子機制有待探究。Wip1對免疫器官的發育及免疫細胞各亞群的增殖、分化和細胞因子分泌的調節機制仍需要深入研究。

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