TLR4信號轉導通路與癲癇的研究進展①

歐陽龍強 綜述 梁日生 楊衛忠 審校 (福建醫科大學附屬協和醫院神經外科研究所，福州350001)

癲癇(Epilepsy，EP)是一組由大腦神經元異常放電所引起的以短暫性中樞神經系統(CNS)功能失常為特征的慢性腦部疾病。海馬是中樞神經系統內對癲癇最敏感的腦區之一，癲癇發作可引起海馬特定區域(如 CA1、CA3)神經細胞凋亡或壞死［1］，引起學習、記憶和認知損害，給病人的生活和工作造成極大影響。我國的癲癇患者約有900萬，其中約75% ～80%可用藥物控制癥狀。但仍有20%～25%的患者無法用藥物控制發作而成為難治性癲癇。臨床上治療癲癇的藥物療效并不滿意，這說明需進一步研究癲癇的發病機制及治療機理，為臨床治療提供新的思路和手段。免疫炎癥反應在癲癇發生與進程中起重要作用。研究顯示即使沒有感染存在，受損或應激狀態細胞發出的信號也能引發免疫反應［2］。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一個重要的天然免疫受體，它不僅能介導脂多糖等外源性配體引起炎癥反應，還能介導受損或應激產生的內源性配體引發炎癥反應。TLR4介導的信號通路能識別內源性配體參與癲癇所致炎癥反應，其具體作用機制尚不完全清楚。

1 TLR家族及其功能

1.1 Toll樣受體及其配體 Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)最早由 Medzhitov 等［3］1997 年在果蠅體內發現，因其胞外段與一種果蠅蛋白Toll同源而命名為Toll樣受體，至今已發現11種人TLRs和13種小鼠TLRs［4］，它們是宿主細胞識別各種微生物致病源的天然受體。

TLRs是一類跨膜模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)受體，分胞外、胞膜和胞內三部分。其胞外區是富含亮氨酸重復序列(LRR)的功能區，可通過識別不同的病原體相關分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMP)引發機體固有免疫應答。胞內段結構類似IL-1受體，故稱為Toll/IL-1同源結構域(TIR)，是一種高度進化保守的結構域，它介導細胞應答的信號啟動。TLRs主要表達于單核細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞等免疫細胞。根據TLRs在細胞表達部位的不同分為兩類，一類是存在于細胞膜上的 TLRl、2、4、5、6、10，其配體主要為細菌產物，其中TLR2常與TLRl或TLR6形成二聚體，識別革蘭陽性菌的脂蛋白、肽聚糖和脂肽以及支原體的脂肽和真菌的酵母多糖［5，6］。TLR4則常協同MD-2和CD14識別革蘭陰性菌細胞壁上的脂多糖(LPS)，TLR5主要識別細菌的鞭毛蛋白分子［6］。另一類是 TLR3、7、8、9，主要表達于細胞內，其主要識別病毒和細菌核酸。其中TLR3識別病毒雙鏈RNA(dsRNA)。TLR7和TLR8識別病毒分子中的單鏈RNA(ssRNA)，TLR9則對細菌和某些病毒的DNA上非甲基化的CPG基序起識別作用［6，7］。

TLRs除了識別上述介紹的外源性配體外，Matzinger［8］的“危險模式”理論提出體內還可出現“內源性危險信號”，這些危險信號主要是機體細胞損傷時產生的熱休克蛋白、抗菌素/防御素、氧自由基、胞外基質降解產物、神經介質、細胞因子、DNA和RNA等物質，這些危險信號主要來自損傷變性、壞死或者凋亡的細胞，它們已被證明可以作為TLR的配體，激活TLR信號通路從而引起炎癥反應。即使沒有感染存在，受損及應激狀態細胞發出的信號也可以引發免疫應答，能識別內源性“危險信號”目前已知的有 TLR2、TLR3、TLR4 和 TLR9。

1.2 Toll樣受體的功能 TLRs主要通過受體胞外段的TIR結構域與病原體的PAMP或“內源性危險信號”相結合，激活細胞內信號傳導通路，最終由進入胞核內的活化NF-κB啟動核內相關基因表達，促使 IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α 及 IFN-γ 等細胞因子合成與釋放，引起免疫細胞的激活并產生炎癥反應。此外，TLRs還具有促進免疫細胞膜表達相關免疫分子以及促進免疫細胞的成熟和活化等功能［9，10］。

2 TLR4

2.1 TLR4與MyD88的結構 TLR4作為細胞表面的模式識別受體，具有TLRs家族的結構特征。它通過協同CD14和MD-2識別細菌脂多糖(LPS)、鞭毛蛋白、表面活性蛋白A等外源性配體，也可以識別內源性配體，如熱休克蛋白 (HSPs)、HMGB1［11，12］。TLR4介導的炎癥反應通過激活基因轉錄編碼炎癥介質的釋放產生［11］。MyD88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)本質是一種胞質可溶性蛋白，具有兩個特殊的結構域，即N端特有的死亡結構域(Death domain，DD)和 C 端保守的 TIR 結構域［13］。N端的DD約有90個氨基酸組成，負責募集下游的含有DD的信號分子進入下游信號轉導。C端的TIR域約有130個氨基酸組成，負責承接TLRs活化信號［6］。MyD88功能缺陷可導致信號傳導中斷。TLR4與相應配體結合后介導MyD88依賴和非依賴兩條信號轉導通路。

2.2 TLR4信號轉導通路

2.2.1 TLR4介導的MyD88依賴信號通路 TLR4被LPS與內源性配體(如 HMGB1)激活后，通過TIR-TIR結構域募集MyD88樣接頭蛋白MAL(MyD88 adaptor-like protein，MAL)和 MyD88，MyD88通過其DD與IRAK(IL-1 receptor-associated kinase，IRAK)家族蛋白分子結合成為信號轉導復合物。激活的IRAK4、IRAK1、IRAK2磷酸化而脫離MyD88/IRAK 復合體［14，15］，與 TRAF6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)結合，TRAF6再依賴泛素激活TAK1(Transforming growth factorβ ～activated kinase，TAK1)復合體，活化的TAK1激活IKKα/IKKβ復合體，后者使核因子 NF-κB的抑制物 IκB(Inhihitory KappaB，IκB)磷酸化之后，再泛素化降解。游離的NF-κB進入細胞核發揮轉錄調控作用，激活IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、及 IFN-γ 等細胞因子的基因表達。同時，TAK1還可激活MAPK家族復合體，后者使AP-1活化后進入細胞核啟動基因表達［6，13-15］(如圖1)。

2.2.2 TLR4介導的 MyD88非依賴信號通路

TLR4通過激活 TRAM(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)與 TRIF(TIR domain containing adaptorinducing IFN-β，TIRF)結合。活化后的 TRIF募集IKKi/TBK1 復合體(復合體由 IKKi、TBK1、NAP1、TANK和兩個IRF3組成)，并使IRF3磷酸化進入細胞核調控 IFN ～ β 的合成［16，17］。同時，TRIF 還可結合受體作用蛋白(receptor inieraeting protein 1，RIp1)激活TRAF6和 FADD(FAS-associated death domain，FADD)，從而誘導MAPK和NF-κB晚期的活化以及細胞凋亡［6，13］(如圖 1)。

圖1 TLR4信號轉導通路Fig.1 TLR4 signalling pathways

3 癲癇與免疫炎癥反應

3.1 癲癇引發免疫炎癥反應 研究顯示，癲癇發作后可激活神經細胞、神經膠質細胞以及大量炎癥介質的釋放，包括白細胞介素類(ILs)、干擾素類(IFNs)、腫瘤壞死因子類(TNFs)，從而引發炎癥反應［18］。Ravizza 等［19］在顳葉癲癇患者手術切除的海馬中檢測到激活的小膠質細胞、星型細胞以及IL-1b、IL-6、TNF-α等炎性指標，而在正常對照組的標本中未發現。Ferriero等［20］在海人酸誘導動物癲癇持續狀態24小時后可檢測到小膠質細胞和星型膠質細胞的大量活化和炎癥因子的大量產生。Vezzani［21］對癲癇動物模型腦組織進行免疫組化發現，IL-1b、IL-6、TNF-α以及一些細胞因子受體最先在小膠質細胞、星型膠質細胞中表達，隨后出現環加氧酶-2(COX-2)、前列腺素、補體系統等的表達上調。小膠質細胞被認為是腦內的“巨噬細胞”，在固有免疫反應過程中發揮著重要的作用［22］，活化的小膠質細胞分泌、釋放 IL-1b、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2 等促炎因子以及自由基ROS、RNS，并通過N-甲基D天冬氨酸受體信號傳導通路抑制神經元的呼吸鏈，使神經元中ATP急劇減少最終因能量衰竭而死亡，這種損傷又反饋促進癲癇的發作及增加其敏感度和持續時間。小膠質細胞釋放的促炎癥因子如IL-1b、IL-6、TNF-α還可活化星型膠質細胞表達COX-2、INOS，產生氧自由基，釋放促炎癥細胞因子及一些神經營養因子(NGF)參與炎癥反應。炎性細胞因子與TLRs在誘導先天性和獲得性免疫反應中起關鍵作用［21］。TLRs能識別損傷或應激所致的“內源性危險信號”作為配體，激活信號通路引起炎癥反應［8］。癲癇可以通過“內源性危險信號”激活TLRs，最終活化核因子-κB(Nudear factor kappaB，NF-κB)，促使 IL-1、IL-6、TNF-α、COX-2、INOS 等細胞因子合成與釋放。

3.2 免疫炎癥反應參與癲癇的發生與發展 大腦內的免疫炎性反應可能是構成癲癇發作與發展進程中的最重要機制之一［21，23，24］。炎癥反應不僅是癲癇的一個結果，還可能是癲癇發作的原因之一［18］。研究顯示［21］神經免疫炎性反應不僅增加神經元興奮性、誘導神經細胞凋亡，還可破壞血-腦屏障，使外周免疫細胞與炎性物質浸入到大腦，在高炎癥因子和高興奮性的病理情況下，谷氨酸攝取受抑制，神經生長因子可引起軸突出芽，異常突觸形成，苔蘚纖維出芽及海馬硬化，形成顳葉癲癇樣病理變化，導致癲癇形成。Friedman等［24］均報道免疫炎癥介質是介導癲癇發作和發展普遍的、重要的機制之一。目前雖然存在 IL-1b、IL-6、TNF-a、TLRs、前列腺素 E2(PGE2)以及補體系統對癲癇發作的產生和加重的證據，但其作用機制尚不清楚［25］。

4 TLR4信號轉導通路與癲癇

癲癇發作時，TLR4在神經細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞中出現異常表達。Kleen等［11］發現TLR4在組織受損和應激時被激活，加劇癲癇的發作。其主要著火點是HMGB1(High-mobility group box-1 HMGB1，)—— 一種染色質成分，由病變或死亡的細胞釋放［12，23］。Maroso 等［12］在海人酸或荷包牡丹堿誘導的小鼠癲癇模型中觀察到，HMGB1與TLR4在海馬的神經細胞、星型膠質細胞、小膠質細胞高度表達。隨后出現癲癇的大幅度增強。應用HMGB1和TLR4拮抗劑后癲癇發作下降。TLR4缺陷的C3H/HJ型小鼠具有抵抗癲癇發作的功能［11，12］。Friedman 等［24］報道 TLR4、IL-1β、TNF-α在癲癇的產生和發展中發揮了重要作用，在某種程度上干預TLR4信號通路等免疫反應能成功預防癲癇發作。由此可見，腦組織中的神經細胞、星型膠質細胞、小膠質細胞表達的TLR4作為重要的炎性受體介導癲癇炎性損傷，并參與癲癇的產生和發展。癲癇發作可激活TLR4和炎性因子，活化后的TLR4、炎癥因子又參與癲癇的產生和發展，炎癥因子可通過TLR4信號通路介導的產生，三者之間形成一個循環通路。因此更深入地了解TLR4及其配體、相關蛋白的相互作用，將有助于開發調節TLR4信號通路的激動劑或拮抗劑，對于癲癇腦損傷的研究提供新的靶點和治療措施。

5 研究意義與展望

癲癇的發生機制復雜，其病理生理機制還不完全清楚，免疫炎癥反應是癲癇的重要損傷機制之一。TLR4及其信號途徑是連接天然免疫和獲得性免疫重要橋梁之一。雖然癲癇與TLR4信號通路之間的關系還處于研究的初級階段，但對TLR4及其信號通路的深入了解將有助于我們進一步了解非病原微生物性炎癥機制及其分子基礎。從而更深刻的弄清癲癇的發病因素及其病理生理過程。為今后新的抗癲癇藥物研制等方面提供新的切入點，并為臨床治療開辟更加廣泛的途徑。

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